超高效液相色谱的七年之痒：未来在何方

Robert STEVENSON

在2004年的匹兹堡会议上，Waters公司(Milford,MA)介绍了一种能够承受最高压力为15 000 psi的ACQUITY UPLC色谱仪，从而导致生产色谱仪器的其他公司不得不加快步伐追赶。随着他们的竞争，造成的后果包括引起忧虑、不确定性和怀疑(FUD)。然而直到2010年春季，市场上最大的7家供应商每一家都才分别推出可以与之竞争的仪器，其中一些仪器的最大压力超过5 000 psi。而对于使用者来说，受益是实实在在的，并且经常带来比预期更有价值的利益。很多关于销售的争论已经抛诸脑后。因此，让我们看看在七年之后UPLC会在未来带来什么。

首先让我们来看看使用者所认知的来自超高效液相色谱(UHPLC)技术的好处。分析的速度和通量上的直接改进是很明显的，并且这是可以预期的结果，但是还有更多的好处。由于峰宽减小和标准分析柱的直径减少(从4 mm到2 mm甚至到更小)，检测灵敏度提高了好几倍。大多数早期的仪器使用者，并没有预见到由于工作流程和分析速度的改进会使效率有很明显的提高。用户发现在很多情况下，接近实时或是实时的结果会帮助决策的制定。这在生产层面是决定性的。Waters公司很快就发展在过程层面上的ACQUITY，对象是拥有ACQUITY PATROLTM的实验室。尽管采用新技术和工作流程的程序设置比较慢，但是PATROL色谱仪正在迅速地得到关注，尤其是对医药品生产的支持。毫无疑问，美国食品和药品管理局(PDA)主动推广的过程分析技术(PAT)正在起着积极的作用。

人们通常关注的一个问题是：传统方法能够过渡到UHPLC上吗？答案是依情况而定。如果这个方法包括等度洗脱，流速是通过与柱内径的比例简单地下降，它保证了线性速率相同。通过柱长的变化比例减少运行时间，同时还需要检查数据系统通过比较临界峰对之间的分辨率来处理窄峰的能力。在大多数情况下，所有上述情况非常简单。最多也就是创建一个新的保留时间表。如果需要更高的可信度，可以对两个仪器进行可能一个月的平行实验，对结果进行比较，结果应该是一致的。

对于梯度洗脱，系统死体积是不一样的。例如，Agilent (Wilmington, DE)推出的Jet Weaver混合器有10到35 μL的死体积，其依赖于所混合体系的成分。这个死体积(混合)是大大小于1100系列液相色谱仪的死体积，所以梯度斜率比一般的(1100)混合器陡峭得多。大多数供应商已经实现通过计算机来转换色谱方法，并且考虑到了流速设置的改变。DryLab(Molnar Institude,Berlin,Germany)也扩展了这项功能，其中还包含耐用性评价。

尽管如此，如果构建的方法不好，在过渡过程中可能就会有很大变化以至于需要新的研究来进行确认。实际上，Agilent已经考虑到从1260和1290与更老型号仪器的连接程序包。例如，如果在Agilent 1100系列仪器上有一个经过验证的方法，1290就能够被“解调谐”给出与1100仪器相类似的性能。通过新旧仪器的比较，然后就能够得到相应的结果(保留时间和临界峰对的分辨率)。通过在适当的位置从1100连接到1290仪器平台，就很容易通过改变方法达到利用1290仪器潜在性能的目的，或者更简单的，只用一个梯度控制来减少其斜率。至少在一些情况下这种运行模式的效果非常好。

另一个问题是：是否所有HPLC模式都能转变到相应的UHPLC。对于反相液相色谱(RPLC)是没有任何问题的。因为RPLC大约占了市场的三分之二，因此这是一个开始转变的基础。正相液相色谱，包括亲水作用液相色谱(HILIC)，也可以进行转变。对于离子交换和体积排阻色谱的答案就没有那么清楚的证明。一般的离子色谱应该行得通，但是关于免试剂模式有很多的问题，在这里膜受到很高的压力。膜的机械完整性是一个需要考虑的因素；除此之外压力能引导渗透流到高浓度的一边，这也是需要控制的。

超高压带来的样品兼容性也是一个需要考虑的因素。超高压对于小分子来说没有什么关系，但是蛋白质和聚集体在很高的压力下结构会发生变化[1]。蛋白质聚集体在2 000 bar的静水压下就能够分解。对于其中一部分来说甚至在更低的压力下就会开始裂解。进一步说，蛋白质的折叠也对压力敏感。高静水压可以展开蛋白质，因此暴露了其与三级结构相关的疏水端。RPLC中的填料由于对疏水区域有亲和作用，会改变蛋白质解折叠的热力学。更糟糕的是，当蛋白质被送到柱内，其构型也会随之变化。最高的压力在柱的入口，如果压力足够高，蛋白可能开始解折叠，暴露了一般难以见到的与固定相相互作用疏水端，但是在出口附近，压力小得多，这就允许蛋白质部分或是全部地重新折叠。这种在柱内的分析物构型的改变，当然会得到非理想形状的色谱峰。通过在线快速搜索，我找不到任何关于高压流动相在色谱分离过程中对蛋白质结构的影响的报告。尽管如此，如果高的压力最后证明对于大蛋白质的分离有一定影响，那么也许可以采用场流分离弥补其缺陷。

1 其他因素

短的柱寿命也是一个经常关注的问题。用于UHPLC的柱子一般的定价是比传统仪器上的柱子高20%或更高。通过比较用于UHPLC的一个2.1 mm内径的色谱柱和传统仪器的一个类似固定相的4 mm内径的色谱柱，早期的对UPLC的质疑指出UPLC柱子不像一般柱子具有很长的使用寿命。Waters公司对此的反击是认为这种情况可能只是偶然发生的，但是在其使用期限内，UPLC柱子由于短的运行时间所以可能会运行了很多的样品。因此，这两种情况都可能是真的。我曾很有限地与一些UHPLC使用者交谈，他们很少认为柱寿命是UHPLC需要考虑的问题。

如果对于样品来说，短的柱寿命是一个需要考虑的因素，那么一些供应商建议用0.2 μm的滤膜过滤流动相和样品。这会除去一般可能会堵住柱子的微粒。大多数的供应商有用于过滤流动相的和样品的配件。

配件是另一个需要考虑的因素。最初，配件是UPLC仪器中的一个很明显的弱点。套管可能滑动，这将会导致管道拉回或是在极端情况下从配件中拉出。幸运的是，后者是很少见的，但是套管的移动的确存在。不过柱效的损失是容易发现并弥补的。现在，一些厂商利用新的设计已经解决了这个问题。Dionex公司(Santa Clara, CA)推出了这种ViperTM配件，它通过独特的设计提供了一个可靠的连接。Optimize Technologies公司(Oregon City, OR)推出了一个新的双套管，只需要用手拧紧就可以使其咬住管壁。

Shimadzu Scientific Instruments公司(Columbia, MD)介绍了一个在Nexera的HPLC进样器中所加入的新的omega流路，该流路保证了进样阀密封面的平整性。相对而言，传统的设计对于系统压力来说有三分之一在转子密封处，但是其余的都在周围。这可能使密封面倾斜和增加磨损，并最终导致渗漏。

2 花费

许多人都受UHPLC的所承诺的性能吸引，但是它的成本如何？既使在这里，甚至在这一点上，改变也是显而易见的。对于大多数人来说，这依赖于进样量。一个6 000 psi的仪器和一个UHPLC仪器，它们的价格差别在40%到100%左右。但是Dionex的Frazer McLeod声称[2]，其通量上的效率增加了10倍。通常来说，效率的提高是决定于进样量。一般来说，当实验室需要更高的分析容量时，就要增加一套HPLC。一次性增加10倍通量是很少见的。但是如果你有这样一套UHPLC仪器，花费是很少的和引人注目的。一套UHPLC仪器比10套传统的色谱仪器要便宜得多。

PerkinElmer (PE, Shelton, CT)公司的Eric Denoyer博士对PE公司不同仪器间的对比经济学分析表格进行了讨论，涉及的仪器主要是PE改进的Flexar FX-10 (10000psi)、FX-15 (15000psi)HPLC系统和一般的HPLC系统如PE200系列HPLC[3]。实验室在几个月之内得到进样量的回报证明相对于其增加的成本是值得的。

同时PE公司的分析节省了溶剂，但似乎忽略了实验室空间的消耗。工作台所需要的空间一般是非常缺乏的，而且十分昂贵的。UHPLC的高通量特点可能会代替一些传统仪器，从而为其他的工作腾出了空间。Dionex公司推出了一个双梯度的方法，它与单个梯度的覆盖区域是类似的。

另外一种情况是如果HPLC仪器使用很少并且从来不运行到它的检出限，那么通过对成本分析建议使用传统的系统(6 000psi)。制备色谱，甚至是实验室规模，可能一直倾向于使用常规HPLC技术来进行分离纯化。

3 UPLC往何处去？

UPLC的未来怎么样呢？UPLC的发展是通过柱技术推动的。如果我们接受更高的压力，那么可以使用更长的柱子，以得到更高的峰容量，这对于分离来说是有用的。当然，可以放弃使用小粒径的填料(比如说10 μm的填料)而制作长的柱子以达到高峰容量，但是太长的运行时间并不符合我们的要求。有趣的是，需要高峰容量的样品的数量是非常少的，至少在今天看来。并且比起简单地使用长的柱子，多维液相色谱可能是一个更加有效地增加峰容量的途径。

减少柱子填料的粒径是另一种选择。然而，在工程上会遇到很大的挑战，比如说流动相的压缩。我们已经知道大概三分之一的泵冲程被用于压缩流动相到20 000 psi。现今的脉冲阻尼器(机械上和电气上的)是非常有效的，但是往复式计量泵在运行的时候会达到临界的状态。因此，最大压力的增加可能将需要一个不同的泵技术，也许是小体积注射泵。

就个人而言，我对UHPLC接下来10年改进的期望：由于色谱仪器产品寿命周期是大约10年，下一代的UHPLC应该在1或2年之内开始出现。我期待的改进是最大压力将会慢慢的增加到35000 psi左右。泵在最高压力工作的能力也会导致流速范围的增加。我们发现最小尺寸在1.4~2 μm的柱填料在10年内都会比较实用。由于在30 000 psi左右的情况下需要避免摩擦热的产生，柱直径将会优化小于1 mm。预填充柱长度的选择将会变长。尽管如此，不同于现今通过对柱的需求来带动它的发展，这些改进将会给柱子带来新的应用。这是一段艰苦的路程。

总而言之，Waters公司因抓住了机遇受到赞赏，用UPLC技术将HPLC带到一个新的水平。在大约40 000 psi提高150%的性能对于开启新领域研究来说其价值并不明显。似乎更可能地是工程师在下一个或两个产品周期将会集中提高(临界状态)的性能。随着单位体积和工程经济学的改进，花费将会降低。

[1] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC113776/.

[2] McLeod, F.UHPLC + Solutions from Dionex.Lecture in Webinar, Nov 18, organized by Lab Manager; http://www.labmanager.com/articles.asp?ID=817.

[3] Denoyer, E.UHPLC + Solutions from Dionex.Lecture in Webinar, Nov 18, organized by Lab Manager; http://www.labmanager.com/articles.asp?ID=817.