干细胞移植治疗甲状腺功能减退症的研究进展

陈丽红，杨凌辉

(1青岛大学医学院，山东青岛266021;2中国人民解放军第401医院)

目前，甲状腺功能减退症(甲减)的主要治疗方法是甲状腺激素替代治疗、异体或异位成体甲状腺移植、胎儿甲状腺供体移植和甲状腺细胞替代治疗等，但均有局限性。近年研究发现，胚胎干细胞(ESCs)经胚胎体发育阶段，在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞［1］，为ESCs源性甲状腺细胞替代治疗甲减提供依据。现结合文献就干细胞(SC)移植治疗甲减的研究进展综述如下。

1 SC及SC分化

SC是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞，能产生表型与基因型完全相同的子细胞，是机体其他细胞的起源［2］。根据其分化潜能分为4类:①全能干细胞:具有自我更新并能分化为任何类型组织细胞的能力，如受精卵和ESCs。②多能干细胞:属分化方向确定的SC，如神经干细胞、造血干细胞等。③定向祖细胞:是多能干细胞分化的下游细胞，其分化和自我维持、自我更新能力受限，如造血祖细胞。④专能干细胞:只能向某一类型的细胞分化，如神经前体细胞。但是如何诱导SC分化为期待的组织或细胞，是目前SC研究领域的重要环节。ESCs是从着床前囊内细胞团或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖细胞分化出来的全能干细胞，是胚胎发育的基础，具有无限增殖、自我更新和多向分化能力。在有饲养层或抑制因子存在的条件下，ESCs能保持未分化状态，一旦去除这些分化抑制因素或添加某些诱导分化因子，就可向某些细胞分化。目前，关于甲状腺SC的诱导分化主要集中在ESCs。

2 ESCs体外诱导分化为甲状腺细胞

甲状腺SC移植的关键是将ESCs定向诱导为甲状腺细胞。以前获得甲状腺细胞的方法是依赖体外培养人或鼠的甲状腺细胞系—FRTL-5细胞株［3］。因其培养物中经常混杂其他类型的细胞，导致培养纯度降低，故不能作为较纯的甲状腺细胞来源。随着ESCs诱导造血细胞、神经及心肌细胞等成功，Lin等［4］开始了ESCs定向诱导分化成甲状腺细胞的研究。

2.1 ESCs体外诱导分化的方法 在体外，ESCs因某些分化抑制因子存在，如成纤维滋养层细胞分泌的分化抑制因子等，不能自动定向分化［5］，保持未分化状态;而维甲酸、二甲基亚砜、六亚甲基乙酰胺及神经生长因子等则可定向诱导ESCs分化。Lin等将ESCs置于DMEM培养基中，并采用15%胎牛血清培养，用1%白血病抑制因子抑制其分化;得到拟胚体(EB)后，用15%胎牛血清、0.5 mg/ml抗坏血酸及1.5×10－4mol/L硫代甘油培养，最终随着 EB成簇生长，ESCs也不断生长，证明ESCs在某些诱导因子作用下能定向分化。因各诱导因子只能诱导唯一的细胞类型，且其诱导机制尚不清楚，故在诱导ESCs分化时带有一定的盲目性。

2.2 ESCs体外诱导分化为甲状腺细胞的研究现状 Lin等［6］将野生小鼠胚胎干细胞CCE株诱导分化为甲状腺细胞样细胞时，发现ESCs发育6 d的EB在基因表达上与正常甲状腺滤泡细胞均可检测到成对框基因8、Na+/I－同向转运体(NIS)、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶和促甲状腺激素(TSH)受体，表明该胚体具有甲状腺功能。为提高ESCs分化期间产生甲状腺细胞的比例，通过研究产生了一种TSH受体启动子［7］，在其控制下，可追踪携带增强型绿色荧光蛋白(GFP)—新霉素双抗ESCs在体外分化期间甲状腺细胞产生的GFP表达。GEP阳性细胞是依赖于ESCs的衍生胚体，如果前2～4 d分化期间使用促甲状腺激素处理，则GFP阳性细胞比例明显增加。这些由ESCs衍生的GEP阳性细胞辅以TSH的无血清环境基质胶中，形成甲状腺滤泡样细胞群［8］。免疫荧光研究证实，在细胞群中有共区域化带有NIS的TSH受体，且NIS在质膜中可专门表达。此外，在这些细胞中可观察到I－摄取活动。此标志着由ESCs分化为甲状腺滤泡细胞成功。

因不同物种的ESCs在某些细节上分化不同，故其用于人类ESCs尚需验证。人类ESCs分化形成内胚叶，类似于脊椎动物在体内原肠胚形成期间发生的内胚叶分化。随后，这些人类内胚叶细胞可在一定条件下分化为更成熟的内胚层器官细胞［9］。因甲状腺滤泡细胞产生于脊椎动物生长期间的内胚叶细胞中，故采用类似方法可能用来刺激人类ESCs分化形成甲状腺滤泡细胞。虽然确切的必要培养条件尚未确定，但这些研究无疑帮助我们发现甲状腺细胞分化的机制。

2.3 人体甲状腺中存在成人SC的证据 目前发现，成人SC存在于人的骨髓、肝脏、胰脏和脑组织中。Thomas等［10］研究SC Oct-4表达和人类甲状腺中最初单独培养的内胚层GATA-4、HNF-4时发现，在某些甲状腺癌细胞中可检测到Oct-4表达，而非GATA-4表达，说明人类甲状腺中存在成人SC和内胚层前体细胞。这些研究将为评估甲状腺SC是否可能有效地治疗甲减提供参考依据。

3 LSC再生治疗的临床应用价值

ESCs本身有很强的自我更新和定向分化能力，其不但对研究甲状腺细胞的分化提供了研究模型，而且为甲状腺基因振作与分析提供了大量细胞来源。通过EB中的甲状腺多能干细胞研究，最终使我们更好地理解甲减等疾病，同时ESCs作为甲状腺滤泡细胞的更新来源，使甲状腺替代治疗成为可能。如果使用细胞替代疗法进行移植治疗，必须满足以下条件:第一，胚胎或成人SC的前体细胞必须确定能够在体外扩增到大批成熟，以替代甲状腺细胞;第二，这些替代细胞必须能够合成甲状腺球蛋白，具有运输碘、碘化物和甲状腺球蛋白的能力，并且能在生理上以适当的方式储存和释放甲状腺激素;第三，必须能够严格控制细胞增殖的能力，以避免移植细胞后发展为甲状腺功能亢进症。

4 问题和展望

最近SC的研究有两个重大的技术突破，一是人类ESCs在体外培养成功;二是成体SC横向分化。这表明成体SC在一定微环境作用下，可横向分化为需要的细胞和组织，起到有效的治疗作用。目前，将ESCs定向诱导分化成甲状腺细胞的研究较少，今后可使用悬浮法将ESCs诱导分化成EB，在合适的培养条件下，通过EB定向分化成甲状腺细胞，通过EB中的甲状腺多能干细胞对甲状腺的发生、发育进行详细的分子水平研究，最终了解甲减等疾病的发病机理。同时，可将ESCs作为载体细胞，利用ESCs的可塑性将其与自身甲状腺结合，将不同的基因信号导入ESCs中，使其在抑制部位表达，为细胞替代治疗结合基因治疗开创可观的前景。

总之，目前对ESCs的研究尚存在伦理学方面的争议，以及其自身特征不确定等问题，且实验结果能否用于人体尚存争议。因此，积极探索成体SC的定向诱导作为甲状腺滤泡细胞的更新来源具有重要意义。

［1］刘雄英，蒋宁一，张绪超，等.体外诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的实验研究［J］.中华核医学杂志，2007，27(1):50-53.

［2］Lin RY.New insights into thyroid stem cells［J］.Thyroid，2007，17(10):1019-1023.

［3］Davies TF，Yang C，Platzer M.Cloning of the Fisher rat thyroid cell line(FRTL-5):variability in clonal growth and 3'，5'-cyclic adenosine monophosphate response to thyrotropin［J］.Endocrinology，1987，12(1):78-83.

［4］Lin RY，Kubo A，Keller GM，et al.Committing embryonic stem cells to differentiate into thyrocyte-like cells in vitro［J］.Endocrinology，2003，144(6):2644-2649.

［5］Berna G，Leon-Quinto T，Ensenat-Waser R，et al.Stem cells and diabetes［J］.Biomed Pharmacother，2001，55(4):206-212.

［6］Lin RY，Davies TF.Derivation and characterization of thyrocyte-like cells from embryonic stem cells in vitro［J］.MethodsMol Biol，2006，330(22):249-261.

［7］Marians RC，Ng L，Blair HC，et al.Defining thyrotropin-dependent and independent steps of thyroid hormone synthesis by using thyrotropin receptor-null mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(24):15776-15781.

［8］Arufe MC，Lu M，Kubo A，et al.Directed differentiation of mouse embryonic stem cells into thyroid follicular cells［J］.Endocrinology，2006，147(6):3007-3015.

［9］D’Amour KA，Agulnick AD，Eliazer S，et al.Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm［J］.Nat Biotechnol，2005，23(12):1534-1541.

［10］Thomas T，Nowka K，Lan L，et al.Expression of endoderm stem cell markers:evidence for the presence of adult stem cells in human thyroid glands［J］.Thyroid，2006，16(6):537-544.