体外人脐静脉内皮细胞的培养鉴定及抗原表达分析

刘长乐，郑心田，李广平，孟恒星，邱录贵

(1天津医科大学第二医院，天津300211;2中国协和医科大学血液病学研究所)

血管内皮细胞(ECs)培养是体外研究人体大血管内皮功能的重要手段。Jaffe等［1］首次从人脐静脉中分离出ECs并在体外培养成功后，人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为体外研究ECs的模型受到心血管研究者的关注。2006年1～3月，本实验应用改良的酶消化法进行HUVECs的体外培养、扩增和鉴定，并检测其表面抗原表达，以用于ECs模型的构建。

1 材料与方法

1.1 材料 脐带，DMEM/F12培养基，胎牛血清，hVEGF，鼠抗人:CD34IgG、VWF IgG、KDR IgG，羊抗鼠 IgG-FITC/PE，Dil-ac-LDL IgG，FITC-UEA-1 IgG，DAPI。FACScar流式细胞仪，包被FN细胞培养瓶，倒置相差显微镜、荧光显微镜，恒温培养箱，高速低温离心机，细胞计数仪KX21型。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs的原代培养 取健康产妇分娩后新鲜脐带20cm，选择无夹痕扭曲凝血阻塞的部分向脐静脉注入0.1%胶原酶溶液至血管充盈，置入37℃无菌生理盐水溶液15min后取出冲洗后合并于同一离心管内离心。弃上清液加入20%胎牛血清的DMEM/F12(pH 7.0～7.2)重悬细胞，再用淋巴细胞分离液离心纯化后接种于培养瓶培养。第2天弃培养液，换入新鲜含10%胎牛血清DMEM/F12培养。每2 d半量换培养液1次，倒置相差显微镜观察生长情况，苏木—伊红(HE)染色观察摄片。

1.2.2 HUVECs的传代培养 在培养第7天，观察细胞长至融合状态后，弃去旧培养基，用PBS液冲洗25cm2培养瓶后加入2 ml 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，收集细胞—酶溶液，离心重悬细胞后按上述条件继续培养。

1.2.3 免疫荧光染色检测 ①Ⅷ因子相关抗原检测:细胞爬片后加入丙酮室温固定，PBS液冲洗干燥后加鼠抗人Ⅷ因子单克隆抗体37℃湿盒反应1 h，PBS冲洗干燥后加FITC标记羊抗鼠IgG，37℃湿盒反应1 h，PBS冲洗干燥后用50%缓冲甘油封片，在荧光显微镜下观察摄片。②摄取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)及吸附荆豆凝集素1(UEA-1)检测:细胞悬液在Dil标记ac-LDL培养液中孵育4 h，1%多聚甲醛固定，漂洗后与FITC标记UEA-1在37℃作用1 h，荧光显微镜下观察。

1.2.4 流式细胞仪检测抗原表达 收集培养细胞用加叠氮钠的PBS-PBA调细胞浓度至5×106个细胞，加入离心管，200 μl/管，含1 ×106个细胞。每管加20 μl FITC/PE标记鼠抗人单克隆抗体避光标记30min。细胞悬于 PBA 中检测 CD31、CD34、KDR、VWF、CD133阳性表达百分比。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下细胞形态 直接观察HUVECs于培养4～6 h开始贴壁，呈单层生长，互不重叠。形态由圆形逐渐铺展呈多角形或短梭形。细胞边界清楚，胞质丰富，胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核。长至6～7 d融合成片，呈铺路石状镶嵌排列，传代培养细胞生长旺盛。HE染色胞核呈蓝色、卵圆形，位于中央，大而不规则，可见明显的核仁，胞质均匀，胞质呈粉红色，胞膜较清楚。

2.2 免疫荧光染色检测 Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测荧光显微镜下胞质中可见大量黄绿色荧光，以磷酸缓冲液替代鼠抗人Ⅷ因子抗体的阴性对照无此反应。摄取ac-LDL和吸附UEA-1的细胞功能检测，Dil-ac-LDL红色荧光，荧光强度高;FITC-UEA-1绿色荧光，荧光强度高;双荧光阳性百分比＞80%;胞核呈蓝色荧光。

2.3 表面抗原表达 CD31为 95.73%，KDR为99.66%，VWF 为 99.57%，CD34为 76.82%，CD133为3.48%。

3 讨论

本实验结果显示，促增殖培养的HUVECs培养4～6 h呈单层贴壁生长，互不重叠。形态由圆形逐渐铺展呈多角形或短梭形。细胞边界清楚，胞质丰富，胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核。长至6～7 d融合成片，呈铺路石状镶嵌排列，传代培养细胞生长旺盛;通过HE染色细胞涂片相差显微镜下观察:胞核呈蓝色、卵圆形，位于中央，大而不规则，可见明显的核仁，胞质均匀，胞质呈粉红色，胞膜较清楚，说明HUVECs与 ECs的形态一致［1］。

本实验应用Ⅷ因子单克隆抗体和FITC标记的二抗进行免疫荧光检测，发现细胞胞质内有大量黄绿色荧光颗粒。ECs具有吸附ac-LDL的功能，血管炎症反应时其特征性表现为内吞ac-LDL增加［2］。UEA-1是鉴定ECs功能的特异性糖蛋白，其可以与具有内皮系表型细胞胞膜上的L-岩藻糖特异结合［3］。本实验显示HUVECs能摄取ac-LDL，并且结合UEA-1，免疫荧光结果＞80%细胞呈双阳性染色。

鉴定 ECs表型特征的常用标志包括 KDR、CD31、CD34、VWF［4］。此外，CD133是分子量为 120 kDa的糖基化多肽，具有造血干/祖细胞和内皮前体细胞表型和功能特征，随着细胞分化成熟CD133表达迅速下降，在分化成熟的ECs不表达。本实验流式细胞仪检测HUVECs(第7天)表面抗原表达:CD3195.73%，KDR 99.66%，VWF 99.57%，CD3476.82%，提示HUVECs表达ECs抗原阳性值极高，细胞纯度高，相反CD133抗原的表达缺失，仅3.84%，说明几乎没有原始细胞和初步分化细胞，因为CD133抗原不被成熟ECs表达，也借此将原始干细胞与成熟分化细胞鉴别开来，此结果与Peichev等［5］报道一致。

［1］Jaffe EA，Nachman RL，Becker CG，et al.Cultureof human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by mor phologic and immunologic criteria［J］.J Clin Invest，1973，52(11):2745-2756.

［2］Ceriello A，dello Russo P，Amstad P，et al.High glucose induces antioxidant enzymes in human endothelial cells in culture.Evidence linking hyperglycemia and oxidative stress［J］.Diabetes，1996，45(4):471-477.

［3］Kaushal S，Amiel GE，Guleserian KJ，et al.Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo［J］.Nat Med，2001，7(9):1035-1040.

［4］Blann AD，Taberner DA.A reliable marker of endothelial cell dysfunction，Does it exist［J］.Br J Haematol，1995，90(2):244-248.

［5］Peichev M，Naiyer AJ，Pereira D，et al.Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+)cells identifies a population of functional endothelial precursors［J］.Blood，2000，95(3):952-958.