睾丸组织中ACRBP的表达及启动子CpG位点的甲基化分析

黄 巍，范 蓉，李希圣，郭文文，罗 彬，宋 慧，肖绍文，谢小薰*

(1广西中医学院第一附属医院，南宁530023;2广西医科大学组织学与胚胎学教研室)

顶体素结合蛋白(ACRBP)是一种能在睾丸生精细胞和多种肿瘤组织中表达，而在其他正常组织中几乎不表达的肿瘤—睾丸抗原(CTA)［1］。DNA甲基化是表遗传学的主要修饰形式，在基因表达调控、发育调节和基因组印迹等方面发挥重要作用。目前发现部分CTA如MAGE、NY-ESO-1、TAG的表达与基因启动子区域CpG岛的去甲基化有关［2～4］。以往，我们已从mRNA水平对ACRBP进行了前期研究，发现其限制性表达于正常组织、选择性高表达于肿瘤组织，并在大鼠睾丸中检测到ACRBP。2010年1～12月，我们研究了ACRBP在人睾丸组织中的定位，预测ACRBP启动子CpG位点序列，探讨其CpG位点在人正常睾丸组织中的甲基化状态及意义。

1 材料与方法

1．1 材料 UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒，rTaq酶、pMD18-T载体，EZ DNA甲基化试剂盒。ACRBP多克隆抗体［5］、人正常睾丸冰冻组织及石蜡组织各1例(由广西医科大学组胚教研室提供)，3例正常睾丸组织切片来源于FDA805正常组织芯片，SupervisonTMHRP试剂盒，ACRBP Bisulfite PCR引物。

1．2 实验方法

1．2．1 ACRBP在人睾丸组织中表达检测 采用免疫组化法。常规石蜡切片处理，切片经高压修复后，用抗ACRBP多克隆抗体孵育，用SupervisonTMHRP试剂盒显色，步骤按试剂盒说明书操作。

1．2．2 ACRBP启动子CpG位点分析 通过NCBI、BDGP(NeuralNetworkPromoterPrediction)和METHPRIMER分析软件，对ACRBP基因进行启动子CpG位点分析，并设计用于Bisulfite PCR的特异性引物。

1．2．3 目的基因CpG位点的甲基化状态检测 采用Bisulfite PCR法。用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒提取人正常睾丸组织DNA，紫外分光光度仪确定DNA含量及纯度。取2 μg DNA至0．2 ml EP 管中，用 TE 稀释至20 μl，加 CT 转换液130 μl，混匀离心后置PCR仪98℃ 8 min、64℃ 2．5 h、4℃终止反应，再按EZ DNA甲基化试剂盒说明书对DNA进行洗脱，获得经亚硫酸氢盐修饰的DNA，－20℃保存。取5 μl修饰后的DNA进行Bisulfite PCR扩增。引物序列:5'-TTTTGGTTATTTTAGGGTTTTGAGA-3'，5'-ACAAATATAAACCTCTCACCCTTCA-3'。PCR反应条件为94℃预变性5 min;94℃变性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环;最后72℃延伸10 min。PCR反应完毕后进行琼脂糖凝胶电泳。切取琼脂糖凝胶上的目的条带(237 bp)，进行纯化，用T4连接酶将该片段连接到T克隆载体上，转化DH5α菌株，通过蓝白斑筛选与PCR鉴定(模板取0．5 μl，余条件同Bisulfite PCR)，挑选10个阳性菌落测序，分析目的基因CpG位点的甲基化状态。

1．3 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件。

2 结果

2．1 ACRBP在人睾丸组织中的表达 4例人正常睾丸组织均出现ACRBP的阳性反应。ACRBP分布于生精小管上皮，呈区域性分布。精子与精子细胞及部分的精原细胞和精母细胞表达目的蛋白，支持细胞为阴性。

2．2 ACRBP启动子CpG位点 通过NCBI查询，获知 LPAR5(6728001～6745297)、ACRBP(6747242～6756580，其转录单位起始于6756580)和 ING4(6759704～6772308)三个基因在12号染色体上的相邻位置，且转录方向是逆向。进一步经 WWW Promoter Scan分析，结果显示ACRBP启动子的区域可能为其转录起始点－184～+67 bp，启动子分数为83．73(Cutoff分数为53．00)。取 ACRBP DNA 全序列前4 000 bp进行METHPRIMER分析，在转录起始点－316～+606 bp区域共有4个CpG岛，Bisulfite PCR扩增的序列位于ACRBP转录起始点－127～+110 bp之间，该区域共存在24个CpG位点。

2．3 目的基因CpG位点的甲基化状态 Bisulfite PCR和阳性克隆PCR鉴定的产物均可在琼脂糖凝胶上的200～300 bp出现阳性条带。对10个阳性克隆的测序结果经 BLAST，证实扩增的序列与ACRBP启动子序列(转录起始点－127～+110 bp)匹配。10个克隆中有3个克隆出现CpG位点甲基化修饰，24个CpG位点中有3个出现甲基化，其甲基化频率为1．67%。每个CpG位点出现甲基化频率的95%可信区间为＜3．7%，所分析ACRBP启动子区域(－127～+110 bp)的CpG位点处于低甲基化状态。

3 讨论

ACRBP参与精子获能、协助单精入卵及精子顶体蛋白的包装与浓缩，是一种特异性的精子蛋白［6］。本世纪初通过基因表达系列分析技术，发现该基因具有编码CTA基因的特点［1］。目前，已发现140多个CTA成员，由70多个CTA基因家族或基因编码［7］。CTA除了在多种肿瘤组织表达外，正常组织中仅表达于生精细胞。精子发生的不同阶段能够表达不同的 CTA蛋白，如 MAGE、NY-ESO-1和SSX家族主要在精原细胞和初级精母细胞中表达;SCP-1只在处于第一次成熟分裂前期的初级精母细胞内;SPANX主要在单倍体的精子细胞和精子中表达［7］。基因表达的调控主要通过遗传学和表观遗传学两种机制实现，表观遗传学是一种不涉及核苷酸序列变化可遗传的基因表达方式的改变，DNA甲基化是表观遗传学的主要修饰形式。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的催化下，以5-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的反应。由于发现多种CTA启动子CpG位点在肿瘤组织和睾丸组织中均处于低甲基化状态，一些学者认为可能与肿瘤发生过程中体细胞甲基化状态的改变有关，去甲基化作用是控制多种CTA基因表达的主要调节机制。

本研究发现，ACRBP在精子与精子细胞及部分的精原细胞和精母细胞表达，生精小管管壁呈区域性的阳性反应，可能与生精小管内各区域精子发生的不同步有关。并首次应用生物信息学分析预测了ACRBP启动子区域序列，测序结果证实该序列与目的基因匹配。生物信息学分析可以快捷自动化分析提交的DNA序列，预测CpG岛和CpG位点。通过Bisulfite PCR测序法发现ACRBP启动子CpG位点为低甲基化状态，与其他CTA在睾丸组织中甲基化状态相似［8］。目前，已知甲基化抑制剂氮杂脱氧胞嘧啶可以上调MAGE、SSX和NY-ESO-1的表达。这些CTA蛋白均主要在精子发生的早期阶段(精原细胞和初级精母细胞)表达。近年来有关DNA甲基化与生殖功能的研究不断深入，在生殖细胞发育过程中，DNA甲基化模式经历了去甲基化以及随后重新甲基化的过程［9］。因此，在精子发生后期阶段表达的ACRBP，其在精子发生过程中的表达机制与DNA甲基化的相关性尚需做进一步研究。

［1］Ono T，Kurashige T，Harada N，et al．Identification of proacrosin binding protein sp32 precursor as a human cancer/testis antigen［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(6):3282-3287．

［2］Imura M，Yamashita S，Cai LY，et al．Methylation and expression analysis of 15 genes and three normally-methylated genes in 13 Ovarian cancer cell lines［J］．Cancer Lett，2006，241(2):213-220．

［3］Adair SJ，Hogan KT．Treatment of ovarian cancer cell lines with 5-aza-2＇-deoxycytidine upregulates the expression of cancer-testis antigens and class I major histocompatibility complex-encoded molecules［J］．Cancer Immunol Immunother，2009，58(4):589-601．

［4］宫时玉，蒋曹德，邓昌彦．DNA甲基化及其生物学功能［J］．华中农业大学报，2005，24(6):651-657．

［5］范蓉，肖绍文，黄巍，等．癌—睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体的制备与鉴定［J］．中国生物制品学杂志，2009，22(8):804-806．

［6］范蓉，罗彬，谢小薰．精子蛋白32研究进展［J］．解剖学杂志，2007，30(4):503-504．

［7］Ghafouri-Fard S，Modarressi MH．Cancer-testis antigens:potential targets for cancer immunotherapy［J］．Arch Iran Med，2009，12(4):395-404．

［8］ Huang Y，Wang Y，Wang M，et al．Differential methylation of TSP50 and mTSP50 genes in different types of human tissues and mouse spermatic cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，374(4):658-661．

［9］Houshdaran S，Cortessis VK，Siegmund K，et al．Widespread epigenetic abnormalities suggest a broad DNA methylation erasure defect in abnormal human sperm［J］．PLoS One，2007，2(12):e1289．