白细胞介素12的研究概况与进展

王 灿，黎晓敏，彭远义

（西南大学动物科技学院，重庆 北碚 400716）

细胞因子是由细胞分泌的一类能在细胞间传递信息、具有多种生物学效应的蛋白质或小分子多肽，主要包括干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素和集落刺激因子等。IL-12是1990年由美国的Stern等人发现的一个细胞因子，最初根据其生物学基本功能将它称为自然杀伤细胞刺激因子或细胞毒性淋巴细胞成熟因子。1991年Gubler等成功克隆表达了CLMFcDNA，并将其命名为白细胞介素-12（IL-12）。此后学者们研究发现IL-12具有多种生物学活性，在免疫调节、抗肿瘤和抗感染等方面具有很重要的作用，显示了它作为免疫佐剂应用于疫苗中的前景。本文从IL-12的分子结构及特点、产生及来源、生物学功能、临床应用现状和基因的克隆与表达等几个方面作如下综述。

1 IL-12的分子结构及特点

具有生物活性的天然IL-12是一种分子量为75kD的糖蛋白，是由40kD和35kD两个亚基（p40和p35）依靠二硫键组成的异二聚体（p70），也是目前发现的唯一由两个不同亚基组成并呈异二聚体结构的细胞因子，也就是说p35和p40两者单独存在时无生物学作用，只有以异二聚体方式结合为p70后才具有生物学活性。除具生物活性的异二聚体p70外，IL-12还能以（p40）2同聚物形式被过量分泌，它是p70的天然拮抗剂，能与IL-12受体结合从而阻断p70与受体结合发挥生物活性。IL-12中的p40基因定位于染色体5q31-33，p35基因位于染色体3q12-13.2。

兰文升等于2002年在国内首次克隆了猪IL-12。序列分析表明p35基因开放阅读框序列与人、小鼠和羊的同源性分别为79.2%、37.6%、86.1%，p40基因开放阅读框序列与人、小鼠和羊的同源性分别为79.5%、53.1%、84.3%。Dante等于1995年扩增了编码牛IL-12的cDNA序列，分析后表明牛p40和p35亚基的氨基酸序列与人和小鼠的同源性分别为84.4%、67.6%和82.2%、58.6%。由以上可知，IL-12在各种属间的同源性普遍较低，因此存在种属特异性。

2 IL-12的产生及来源

IL-12主要由单核细胞、巨噬细胞产生，部分来自树突状细胞、中性粒细胞、郎格罕氏细胞等。有研究表明，在很多组织中如淋巴组织（脾、胸腺、骨髓）、非淋巴组织（肝、肾、肌肉）均能表达IL-12，而在受到刺激的淋巴组织中可见IL-12的高水平表达。在体外条件下，LPS、ConA、PHA能诱导脾细胞和外周血单核细胞产生IL-12。A.Premraj等（2006）发现p35和p40亚基均可在脾脏细胞中表达，但p40亚基的表达量在脾脏受到刺激后8～24h内有所升高，而p35亚基的表达量没有波动。

3 IL-12的生物学功能

3.1 对T、NK等免疫细胞的调节作用 IL-12能增强NK/LA K细胞的溶菌活性，作为活化的T细胞和NK细胞的生长因子促进T细胞和NK细胞增殖。IL-12可明显刺激静止的或激活外周血T淋巴细胞、NK细胞分泌IFN-γ，并与IL-12协同作用，但静止的细胞需要辅助T细胞的参与。IFN-γ的产生反过来活化巨噬细胞产生更多的IL-12，形成二者的正反馈途径，共同调节细胞亚群分化。IL-12还能促进T细胞表达CD40L，使T细胞通过CD40L与B细胞上的CD40L相互作用，从而促进B细胞的分裂增殖；同时IL-12可使增殖的B细胞分化为浆细胞并分泌IgM，增强体液免疫。

3.2 对Th1细胞的诱导和对Th2细胞的抑制作用 在人体和鼠，已证明IL-12是Th1产生的必需因子，它可促进Th1细胞的分化和功能的提高，同时抑制由IL-4介导的Th2细胞的分化。在体外用过敏原作用于CD4+细胞后生成Th2型细胞，后者可分泌高浓度IL-4和低浓度IFN-γ；但当有IL-12存在时，则生成Th1细胞，只分泌IFN-γ，而不分泌IL-4。因此，IL-12和IL-4分别支持Th1和Th2细胞的分化。通过一定的正负反馈调节机制，Th1细胞分泌的IFN-γ可进一步增加单核细胞产生IL-12，减少IL-10产生；Th2分泌的IL-4和IL-10则抑制IL-12的产生。另外，IFN-γ可增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性，并通过抑制Th2细胞下调体液免疫，使Th细胞的分化向Th1方向进行。Th1细胞在细胞免疫中尤其是在宿主抗胞内细菌感染中起重要作用。由此可见，IL-12通过调节Th1/Th2平衡，在细胞介导的免疫中发挥了积极作用。

4 IL-12的临床应用现状

4.1 抗肿瘤 IL-12增强NK细胞和CTL细胞的免疫应答，并产生IFN-γ，表明它可能具有抗肿瘤作用。目前应用IL-12基因治疗黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、消化道恶性肿瘤、多形性胶质母细胞瘤等晚期肿瘤已在临床I、II期中可见，并取得了一定的疗效，且未出现明显的不良反应。

Lenoard等（1997）用rhIL-12进行I期临床试验，在肿瘤和感染患者中按剂量递增给予IL-12，结果显示rhIL-12在500 ng/kg时安全。但在II期临床试验中，12例患者中出现2人死亡，说明药物的耐受性与剂量有关。Portielje等通过对晚期肾癌患者使用rhIL-12进行临床Ⅰ期研究，观察到相同剂量时首次注射的不良反应要比再次注射严重。rhIL-12首次给药的最大耐受剂量（MTD）是500ng/kg，再次给药的MTD是1000mg/kg。在治疗过程中，第1d使用rhIL-12后间隔7d，到第8d开始重复使用rhIL-12，每周3次，连续2周，活检显示IL-12和IFN-γ在血中的浓度上升，证明瘤内注射质粒DNA产生了有益的临床效果。在最近的研究中，将IL-12基因与其他基因联合应用，通过相互间的协同或叠加效应来治疗肿瘤，这已成为一个重要的发展方向。

4.2 抗病毒感染 IL-12对多种类型病毒的复制和表达都具有抑制作用，它可通过增强病毒感染后的特异性和非特异性免疫应答来发挥抗病毒作用。IL-12可以增强病毒感染组织中MHCⅠ、Ⅱ类抗原的表达，而由IL-12刺激的NK细胞和CTL细胞对病毒感染细胞清除的第一步即是对MHC限制性病毒感染细胞的识别，因此IL-12是调节宿主免疫反应的关键分子。杜德伟等用HBV DNA疫苗（PCR3.1-S）与编码小鼠IL-12的真核表达载体共同免疫小鼠，然后测定CTL细胞杀伤活性，结果显示有IL-12组的CTL杀伤活性显著高于无IL-12组。说明IL-12的真核表达载体能提高小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答，可以用于抵御乙型肝炎病毒的感染。

4.3 抗寄生虫 因IL-12能够诱导机体免疫反应向Th1型优势分化，在细胞免疫中起重要作用，所以在抗血吸虫感染方面也有重要作用。喻鑫玲等用SjCTPIHsp70与IL-12联合免疫水牛，对于水牛血吸虫的感染有一定的免疫保护性作用。

5 IL-12基因的克隆与表达

p35和p40两者单独存在时无生物学作用，只有以异二聚体方式等比例结合后才具有生物学活性。许多研究者为解决该问题，在IL-12克隆表达时采取了不同策略以实现双亚基的同步表达。到目前为止，人、鼠、牛、猪等多种动物的IL-12均已可以通过病毒、质粒等载体在原核与真核表达系统中表达，且具有生物活性，为IL-12在免疫和治疗方面的应用奠定了物质基础。

夏向文等采用重叠PCR的方法成功构建了携带报告基因（GFP）和人IL-12 p35、p40亚基基因的重组真核质粒pEGFP-C1_IL-12，并在人肝癌细胞系HepG2中成功表达。他们首先分别扩增出p35和p40亚基基因，设计两亚基引物时在p40的下游引物和p35的上游引物中分别加入p35和p40的部分互补序列，从而实现了采用重叠PCR的方法连接两个亚基基因得到全长串联基因的目的。

理想的基因转移载体是IL-12在临床中进一步应用的关键。病毒载体的转染效率高，但制备成本也高，过程烦琐，且体内免疫原性强，妨碍载体的重复注射。相比之下质粒载体成本低且制备简便，但其转染效率相对较低。考虑到如上问题，李晓敏等利用1999年出现的水流动力学注射方法将表达小鼠IL-12的质粒转移到小鼠体内，从而解决了质粒转染效率低的问题。

6 应用前景

传统的疫苗免疫手段仍然存在问题，比如弱毒疫苗存在可能的安全问题，灭活疫苗虽然安全但其免疫效力不甚理想，DNA疫苗具有良好的发展前途但仍需不断完善。IL-12因其独特的免疫调节作用，十分适合作为免疫佐剂改良现有的DNA疫苗，尤其针对细胞免疫，对提高机体抗感染能力的效果良好。另外，IL-12也可用于对肿瘤等疾病的治疗，但治疗时的用量、使用时间等都有待进一步研究。

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