骨髓间充质干细胞在股骨头坏死治疗中的应用进展

张铭杰,何伟,张庆文,李勇,欧志学

(1.广州中医药大学,广东广州 510405;2.广州中医药大学第一附属医院关节一科,广东广州 510405)

股骨头坏死是由于不同病因破坏股骨头的血液循环,最终导致股骨头塌陷、髋关节功能障碍的一种慢性、致残性疾病,严重影响了患者的生活质量。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有强大的自我增殖和多向分化潜能,可通过诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及肌细胞等多种细胞谱系。随着对MScs研究的不断深入,对非创伤性股骨头坏死的病理机制有了新的认识,同时为骨坏死的治疗提供了崭新的思路。本文就M SCs的生物学特性及其在骨坏死领域中的研究和应用进展作一概述。

1 骨髓间充质干细胞的生物学特性与鉴定

M SCs来源于中胚层,具有干细胞的共同特性,能够自我增殖并具有多向分化潜能[1]。研究显示在体外培养中M SCs每传代一次,细胞数增加约2.2倍,且在体外分裂38次以上仍保持干细胞多向分化潜能。M SCs中约有20%处于静止期(G0期),即足以维持增殖分化所需的细胞供给,且在经体外传代20～25代后,细胞形态、生长曲线、免疫表型仍无明显变化,在多代培养后仍能保持染色体核型和端粒酶活性不变[2]。对细胞周期的研究显示,只有少数M SCs正在活跃地复制(约 10%处于 S+G2/M期),而大多数细胞处于 G0/G1期。细胞周期每个阶段的监控点和时间跨度均不明确,高比例的 G0/G1期细胞暗示着M SCs具有高度分化潜能[3],在特定的理化条件与细胞因子诱导下,M SCs可以分化为中胚层的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等,也可跨越胚层的界限,向外胚层的神经元样细胞、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞分化[4,5]。

通过光学显微镜观察,在培养液中 M SCs显示出类似成纤维细胞外观,并与成纤维细胞有一定同源性的特征。目前常用干细胞的表面标志来鉴定M SCs,干细胞的表面标志是指覆盖在细胞表面的受体,它能选择性地结合或黏附其他信号分子。通常认为,M SCs体积小,核浆比大,不表达分化相关的标志如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原、碱性磷酸酶或骨涎蛋白。在细胞贴壁附着后则细胞均一致地表达 SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等多种表面蛋白[6]。其中 CD44是多种配体的受体,在骨髓中对细胞外基质构建起主要作用,是M SCs的重要标志物[7]。M SCs不表达造血细胞表面标志,如CD14、CD34及CD45,也不表达主要组织相容性复合物分子[8]。随着人们对 M SCs研究的不断深入,将会有更多的骨髓间充质干细胞的生物学特性被逐步揭示。

2 骨髓间充质干细胞的分离、纯化与成骨诱导

由于骨髓细胞的组成具有不均一性,以及 MSCs在骨髓中含量极少,只占有核细胞的1/106～1/105,因此分离高纯度的MSCs比较困难,也成为M SCs应用研究的关键。目前常用分离 M SCs的方法有密度梯度离心法、贴壁筛选法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分离法。贴壁筛选法也称全骨髓法,它是利用 M SCs贴壁生长的特性,通过反复换液去除悬浮细胞而获得 MSCs,单纯贴壁筛选法获得的M SCs纯度不高,易混有许多骨髓造血细胞,且不易通过换液传代去除[9]。免疫磁珠法和流式细胞仪分离法虽然可以获得相对纯度较高的M SCs,但是成本昂贵,较难进行大规模的应用,而且在分离过程中对细胞活性有一定的影响[10]。而密度梯度离心法简便易行,通常与贴壁筛选法结合使用,利用 Percol1分离液 (密度在 1.073～ 1.082kg/L)可获得均一性较高的M SCs[11]。Percoll是包被了聚乙烯吡咯的直径为15～30mm的胶体二氧化硅颗粒,在液体中颗粒大小不一,在一定离心场中可形成一定密度梯度,不同密度的细胞分布在不同的密度层内,借此可将 M SCs与其他细胞分开,从而达到分离M SCs的目的。

由于 MSCs具有多方向分化的特点,而骨组织工程学要求其向单一方向分化,所以 M SCs的定向诱导具有重要作用。M SCs为条件成骨细胞,许多学者研究表明,地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C是M SCs向成骨细胞分化和体外成骨的必要条件[12]。地塞米松在成骨分化早期以促进基质合成为主,后期以促进钙化为主[13];维生素 C的作用主要是促进体外培养细胞合成胶原,形成钙化,同时调节碱性磷酸酶活性,而碱性磷酸酶在成骨细胞体外钙化中起决定性作用。β-甘油磷酸钠可以提供骨组织在体外培养体系中发生沉淀所需的磷离子,从而加速结节的钙化。用上述诱导分化体系对不同代次 MSCs进行成骨分化,细胞逐渐增大,变为多角形或鳞形,随着时间的推移,细胞逐渐汇合,进而矿盐沉积并融合成圆形或卵圆形的钙化结节。诱导分化20d时碱性磷酸酶阳性百分率及活性均较诱导前明显升高,以第3代最高,碱性磷酸酶染色阳性率达 90%以上,5代以内无显著差异,第 6代后逐渐减低。碱性磷酸酶是成熟成骨细胞的标志酶[14],也是评价机体成骨活性和组织分化能力的特异性指标,而且其活性的高低与成骨细胞分化呈正相关。除此之外,1,25-(OH)2维生素 D3、骨形态发生蛋白及转化生长因子等也可诱导M SCs向成骨分化[15]。但这些诱导剂发挥作用的机制、诱导剂间的相互作用、最佳量效比和序贯应用等问题尚未完全明确,有待进一步研究。

3 骨髓间充质干细胞与股骨头坏死发病机理

3.1 股骨头内骨吸收与骨重建的平衡关系 股骨头坏死不同的病因最终都造成微循环损害,微循环障碍是股骨头坏死的共同病理机制。无论原发性还是继发性股骨头坏死,决定其病理演变的因素可概括为3个方面。a)病因;b)由破骨细胞、成骨细胞介导的骨吸收与骨的有效重建速率的平衡关系;c)生物力学作用[16]。病因最终造成微循环损害,骨细胞、骨髓组织坏死、MSCs向成骨细胞分化能力下降。

当股骨头坏死时,破骨细胞对失去保护的骨小梁吸收增强,骨小梁因吸收而变得稀疏细小。另一方面因骨小梁中的骨细胞坏死失去了矿物代谢功能,其机械强度随之下降,当应力传导时,骨小梁极易骨折。在骨坏死吸收的同时,修复的强弱取决于供血状态、骨小梁表面的骨内膜及骨髓的功能状态。M SCs分裂增生,在骨坏死区出现富含成纤维样母细胞的结缔组织,毛细血管也再生,骨内膜残存的成骨细胞及来自于 M SCs分化的成骨细胞合成骨基质,重建坏死的骨小梁。通常在正常与坏死骨组织间出现一个修复反应区,该区骨的形成和吸收都较为活跃,如果吸收的骨不能由新生的骨有效替代,将发展成一软化区,当机械负荷在此区传递时,一方面通过 wolf定律刺激骨的重建,另一方面又可导致骨折,引起塌陷发生。因此,骨的吸收速率及新生骨的有效重建速率应保持一定的平衡关系,而这种关系最终由破骨细胞的活动、M SCs向成骨细胞分化的能力及成骨细胞的功能状态决定[17],在股骨头坏死的病理进展过程中具有重要作用。

3.2 病因作用下的 M SCs活性与分化能力对股骨头坏死的影响 临床上大剂量应用激素是引起股骨头坏死的常见原因。然而,地塞米松是实验室常用的诱导 M SCs向成骨细胞分化的培养条件。对此,许多研究者发现在一定情况下地塞米松可使MSCs分化向脂肪细胞进行。早在1992年Beresford等[18]研究发现,在M SCs培养时当原代和第2代都加入地塞米松则 MSCs向成骨分化为主;若原代没有而仅在第 2代加入地塞米松则向成脂肪分化为主;若在原代用地塞米松而在第2代加入维生素D3则增加成骨分化,抑制成脂肪分化。这表明在一定条件下地塞米松可促使 M SCs主要向脂肪细胞谱系分化,其可能部分揭示了大剂量应用激素后股骨头骨髓内脂肪组织增多,骨内压升高,导致骨微循环障碍,同时骨修复过程缓慢,从而发生股骨头缺血性坏死的机制。并且这与坏死股骨头病理检查骨髓中脂肪细胞增多增大的表现也是一致的[10]。

为此,一些采用不同方法和观察指标的实验都证明了激素对 M SCs向成骨分化的抑制作用。Li等[13]研究在基因表达水平地塞米松对D1细胞(人为建立的一种源于骨髓可分化为成骨细胞或脂肪细胞的细胞系)的影响,结果显示激素在体外增强了M SCs向脂肪细胞分化,降低了其向成骨细胞分化,而且抑制血管内皮生长因子的表述。Cui等[20]利用大鼠M SCs中的D1细胞系来分析激素对MSCs的分化影响,发现地塞米松在降低Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达的同时,刺激了M SCs向脂肪细胞的分化以及骨髓脂肪的积聚。这表明激素介导的分化有使成骨的骨髓在体内向成脂肪细胞转化的趋势,可能促使骨质疏松或股骨头坏死的发生。

除了细胞和动物实验,已有大量的相关临床研究。Gangji等[21]比较了 13例股骨头坏死和8例骨关节炎病人转子间区成骨细胞的碱性磷酸酶活性、1,25-(O H)2维生素 D3的敏感性及胶原合成水平,结果显示股骨头坏死病人转子间区成骨细胞的增殖能力下降,并认为转子间区成骨细胞的功能改变是股骨头坏死的发病机理之一。王佰亮等[22]检测激素性股骨头坏死患者股骨干骺端M SCs的数量与增殖活性,采用密度梯度离心法分离 MSCs,再经贴壁筛选,对第 3代M SCs,用 M T T法、流式细胞仪法测定细胞生长增殖水平及细胞周期,研究结果显示激素性骨坏死的股骨头颈部M SCs的增殖活性明显低于正常对照组,并推测激素可能是通过降低了 M SCs增殖活性或增殖分化能力及改变其分化方向从而引起骨坏死。 Hernigou等[23]通过比较 41例股骨头坏死(特发性11例,激素性 14例,酒精性16例)和33例正常人髂嵴部位造血干细胞和M SCs的活性,发现股骨头坏死患者造血干细胞和M SCs活性较正常人均有明显降低。后来又比较了激素性和镰状细胞病股骨头坏死与正常人股骨近端骨髓的活性,骨髓由股骨头坏死区周围和转子间区穿刺取得,培养成纤维集落形成单位评估 M SCs的活性,结果发现激素性股骨头坏死组的集落单位数量较其他两组明显减少。并提出以下假说,即激素性股骨头坏死患者的骨髓活性下降可能是对周围骨严重损伤的非特异反应,而与骨坏死范围无关;骨髓活性下降可能与激素治疗有关,而与坏死无关;因激素治疗而发生骨坏死的患者,其原因可能与骨髓活性下降有关[24]。

关于酒精对MSCs影响的研究目前相对较少。Suh等[17]在髋关节置换手术时取酒精性股骨头坏死和股骨颈骨折的样本,从股骨近端取材共 33例,将骨髓中的 M SCs分离、培养、扩增,比较倍增时间和分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力,研究显示酒精性股骨头坏死患者 MSCs分化为成骨细胞的能力下降,提示这可能与股骨头坏死的病因有关。孙伟等[25]研究酒精性股骨头坏死患者股骨干骺端M SCs细胞周期的变化,采用流式细胞仪法测定第 2代 M SCs生长增殖水平及细胞周期,结果与正常对照组比较,酒精性坏死组G0/G1期细胞比例升高,S+ G2M期细胞比例降低,增殖指数降低,研究认为酒精性骨坏死的股骨干骺端M SCs增殖分化能力下降,在酒精性骨坏死的发病中可能起到一定作用。已有很多研究观察到酒精干预后实验动物的脂代谢紊乱,骨髓内脂肪增加。体外研究中,Wang等[26]按0.03、0.09及0.15mol/L的浓度在小鼠的 M SCs中加入酒精4～12d,研究表明酒精可以诱导M SCs分化为脂肪细胞,脂肪细胞随酒精浓度和作用时间而增加;且加了酒精的 M SCs碱性磷酸酶活性消失,成骨细胞减少、细胞内脂肪堆积导致骨细胞死亡,这可能与酒精性骨坏死的发病机制有关。

从干细胞的活性与分化角度探讨非创伤性股骨头坏死可能的病理机制,为骨坏死病理机制研究提供了一条新思路。但是目前的研究手段与实验方法尚存在不完善的地方,尚未建立一套完整公认的理论体系。作者认为,非创伤性股骨头坏死,尤其是激素性股骨头坏死,可能是一种由于M SCs活性及分化发生改变而引起的疾病。在激素的作用下,通过全身途径使M SCs的增殖活性、分化能力及分化方向发生改变。作者经过临床长期观察推测,这种骨髓活性异常通常是全身性的而并不仅仅局限于股骨头周围,这也可以解释为什么部分激素性股骨头坏死患者可以同时伴有肩关节、膝关节等全身多关节的骨坏死。在激素或酒精等致病因素的诱导下,患者的股骨干骺端附近(非坏死区)的 M SCs数量减少及活性减弱,从而使股骨头成骨能力下降,而成脂肪分化增多,导致骨微循环障碍,使死骨在吸收后不能有效修复,进而打破了骨吸收与骨重建速率的平衡关系,在负重外力作用下,最终致股骨头塌陷。这可能是非创伤性股骨头坏死的重要病理机制之一。

4 应用骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死方法研究

对许多难治性疾病而言,细胞移植无疑是一种行之有效的方法。将具有某种特定功能的细胞移植到体内相应受损部位,这不仅可以恢复该部位的部分功能,而且避免了传统药物治疗所引起的毒副作用。MSCs具有强大的成骨、成软骨等多向分化潜能和增殖能力,现已经广泛应用于修复骨和软骨缺损、组织损伤、股骨头坏死、骨质疏松及骨关节炎等临床多领域。如上所述,非创伤性股骨头坏死的病理机制可能在于患者股骨干骺端附近的 M SCs数量减少及活性减弱,导致股骨头成骨能力下降,使死骨在吸收后不能有效修复而最终塌陷。目前已有研究尝试对骨坏死患者给予 M SCs移植,以期达到促进坏死修复的目的。

4.1 髓芯减压并 M SCs移植术 髓芯减压术是最经得起实践考验的治疗早期股骨头坏死的微创手术方法,目的是通过髓芯减压打断骨内高压-组织水肿-骨内高压的恶性循环,打通阻碍坏死修复的硬化带,改善坏死区血供。在髓芯减压基础上进行M SCs移植术,可以提供促进股骨头修复重建的种子细胞,有利于加速新生骨的重建与爬行替代。

Hernigou等[27]采用髓芯减压加自体骨髓移植治疗股骨头坏死 116例 189髋,取髂前上棘骨髓血离心后得到干细胞悬液,在髓芯减压后,插入一小套针管,先注入少量造影剂,以了解干细胞可能扩散的区域,再从套管针注入制备好的干细胞悬液。术后经平均随访7年,在塌陷前期(Ⅰ～Ⅱ期)进行治疗的 145髋,只有9髋需要再次手术行关节置换,而在塌陷后期(Ⅲ～Ⅳ期)治疗的44髋,有 25髋需要再次手术行关节置换。孙伟等[28]回顾性总结分析髓芯减压联合自体M SCs移植治疗早期股骨头坏死的疗效,自患者双侧髂前上棘连续抽取骨髓血300～400 mL,分离采集中间层单个核细胞,确认坏死病灶后,以3 mm空心钻钻入,于骨坏死区软骨下骨5 mm处用 50mL注射器将浓缩的细胞悬液缓慢注入股骨头内,并与单纯髓芯减压组相比较,术后随访12个月。研究认为髓芯减压联合自体 MSCs移植是治疗 ARCOⅠ～Ⅱ期股骨头坏死安全有效的方法,临床 Harris评分和病理影像学观察均优于单纯髓芯减压术式,并认为对于 ARCOⅢ期患者,两种方法治疗效果均欠佳。任弘等[29]治疗 ARCOⅠ c～Ⅱ c期股骨头坏死患者 25例 30髋,于双侧髂前上棘穿刺取骨髓血约 50～ 100mL,利用密度梯度离心法提取干细胞,与大转子区凿取的松质骨充分混合,顺髓芯减压通道送入股骨头内并适力夯实,术后配合高压氧治疗,随访 1年,手术前后 Harris髋关节评分优良率由术前的 43.3%增加到术后的 90.0%。

作者认为,股骨头坏死的治疗应根据患者年龄、分期、坏死面积、位置及塌陷危险性等进行个体化选择,只有正确地掌握治疗原则,针对不同分期采用相应方法,才能获得最佳疗效。从以上研究来看,对于塌陷前 ARCOⅠ～Ⅱ期股骨头坏死,髓芯减压并 M SCs移植术取得了良好的手术效果,但对于塌陷后Ⅲ～Ⅳ期患者,此种手术方式疗效欠佳,治疗上须慎重选择。塌陷是股骨头坏死疾病性质转归的关键,塌陷后的保髋治疗是长期困扰骨科界的一个棘手的难题。一旦塌陷进入中晚期(塌陷程度大于 4 mm,时间大于 6个月),则难以有比人工关节疗效更确切的治疗方法[30]。

4.2 M SCs动脉灌注 股骨头坏死后尽管保髋治疗方式千变万化,但是改善股骨头内血供始终是本病治疗的主要方向之一,自体干细胞移植血管再生技术的出现为其治疗提供了更为广阔的前景。Kocher等[31]通过实验证实,M SCs和内皮前体细胞可以促进缺血模型的血流恢复。 Kinnaird等[32]在给鼠缺血性后肢肌肉注射培养的骨源性干细胞后发现,骨源性干细胞可以促进侧支循环及肢体功能恢复,并且与血管生成有关的细胞因子基因表达水平增高。季卫锋等[33]应用M SCs动脉灌注治疗兔股骨头坏死动物模型,病理组织学及四环素荧光标记发现,M SCs组治疗后 2周即可见大量间充质细胞增生,大量血管增生,周围骨小梁表面有明显新骨形成,与对照组相比,MSCs组显效时间更快捷,更容易诱导再骨化过程。杨晓凤等[34]采用超选择性股骨头供血动脉干细胞移植术治疗股骨头坏死患者122例,85.1%患者髋关节疼痛均有不同程度的缓解,其中15例患者干细胞移植后6个月行股骨头供血动脉造影术,发现不仅股骨头区有大量血管新生,原已闭塞的动脉也重新开通,血流速度增快,局部血液循环明显改善;12～24个月 20例股骨头X线、CT可见骨质病变获得改善,如坏死区缩小,新骨形成。

M SCs选择性动脉灌注与开放性股骨头干细胞移植术比较,具有干细胞存活分化环境优良、手术微创、不良反应少及患者依从性好等特点。该术式可能有以下几方面作用。a)疏通发生病变的股骨头内血管,改善静脉回流,降低骨内压,恢复或改善股骨头的血供。b)改善或增加股骨头坏死区域周围及髋部各组织的血液循环,为股骨头坏死区域提供良好局部环境的血供。c)M SCs同时具有保护局部血管内皮,促进血管内皮细胞修复、再生及血管增生的作用。

4.3 M SCs与骨组织工程技术 组织工程是应用细胞生物学和工程学原理,将体外培养的功能相关的活细胞种植于天然或人工合成的具有良好生物相容性和可降解性的聚合物支架上,复合移植于体内组织器官缺损部位,完成修复和再造。组织工程的三要素可归纳为种子细胞、信号因子和支架材料[35]。种子细胞是组成新的结构组织的必需成份,这些细胞可以是外源性的或来源于局部环境[36]。信号因子能够引导细胞向适宜的方向分化,这些信号因子可以由外部供给,如纯化的蛋白质,或由转染细胞产生或由细胞自分泌产生的内源性因子[37]。支架材料是指能够为细胞黏附、生长、分化提供一种基质,并能植入生物体的材料,它是构建组织工程的最基本构架[38]。理想的骨种子细胞应该具有以下特点。结构比较简单,是不具有特定机能的原始细胞;取材容易,对机体损伤小;体外培养时增殖力强;自我更新,一定的条件下能向特定的方向分化;稳定表达成骨细胞表型;植入体内后能继续产生成骨活动;无致瘤性。在种子细胞的选择方面, M SCs具有强大的分化潜能和增殖能力,其来源、分离方法、分化组织类型等在修复股骨头坏死骨缺损方面有其独特的优势,是骨组织工程种子细胞的理想选择。支架材料复合M SCs在体内组织再生过程中可能发挥以下几方面的作用[39]。a)在结构上加强缺损部位的强度;b)阻碍周围组织长人;c)作为体外接种的细胞在体内扩增和增殖的支架;d)利用与细胞整合以及受体的相互作用,作为一种细胞功能调节因素;e)作为细胞、生长因子和基因的生物载体。按照获得材料的过程,支架材料分为天然类和人工合成类。天然支架材料是在自然界中存在的能作为骨组织工程支架材料的物质,包括同种异体骨、异种骨胶原、氨基多糖、蛋白聚糖等。随着化学工业中高分子聚合技术、塑料加工技术的发展,根据仿生学原理结合人体组成物质、代谢产物的情况,利用化学合成的手段,合成了人工支架材料,包括生物陶瓷类和生物高分子聚合物类等。其中部分已应用到临床或者实验研究中,并取得了良好的效果。

孙伟等[40]通过扫描电镜观察磷酸三钙多孔生物陶瓷与兔 MSCs复合培养体内成骨的超微结构,了解其在股骨头坏死骨缺损修复中的成骨效应,结果表明 M SCs与磷酸三钙多孔生物陶瓷复合后具有良好的成骨性,该支架材料适合M SCs黏附、生长、增殖和分化,可应用与股骨头坏死骨缺损的修复。张晔等[41]以脂质体介导pCDNA3-Ang-1质粒转染体外分离培养的兔 MSCs,与磷酸三钙陶瓷复合,修复兔液氮冷冻股骨头坏死模型。实验组较对照组血供改善,股骨头修复加强,研究认为 M SCs与材料复合生长良好,具有良好的组织相容性。碳酸三钙陶瓷作为支架材料,与有机材料比较,不但具有与人体骨组织矿物质相似的钙,而且钙磷比例小于1.6,可以在体内逐步降解[42];另外 ,陶瓷烧结形成的多孔结构,为细胞生长提供了空间,孔与孔之间彼此连接,为新骨长入提供了场所,同时也有利于长入材料深部的血管彼此相通,保证深部组织的营养[43]。

骨组织工程学的兴起为 M SCs治疗股骨头坏死提供了有力的支持,其作用机制可能在于：a)为信号因子提供了良好的载体,使得 MSCs在成骨因子的作用下更有效的向目标组织分化,从而提高生物材料的骨诱导能力。b)支架的使用保证了在坏死局部有较高浓度的M SCs,以促进成骨。c)在坏死的股骨头内建立有利于新生毛细血管、血管周围组织和骨祖母细胞长入的三维结构。但就目前而言,所有支架材料还处于研究开发阶段,存在诸如价格昂贵,技术不成熟等缺点,临床上应用效果还有待于进一步验证。

4.4 补肾法诱导M SCs成骨分化研究 中医学认为“肾主骨、生髓”,“肾藏精,精生髓,髓养骨”。肾气固秘、肾精充盈,则能充养骨髓,骨髓充盈,则骨骼坚固。若肾气亏虚、肾精不足,肾不能主骨,则骨骼脆弱,发生骨折甚至骨坏死等。股骨头坏死属于“骨蚀”、“骨痹”、“骨痿”、“瘀血”范畴。现代医学所讲的高脂血症、脂肪代谢紊乱是股骨头坏死的重要病理机制,过劳、久服汤药(过度酗酒)导致肾气虚损,肾气不足无力推动气血运行,气滞血行不畅,血瘀闭阻经脉,瘀血不去,新血不生,从而骨枯髓减,则易发生股骨头坏死。可见“肾虚”、“血瘀”为股骨头坏死病理变化的核心。

从干细胞角度阐释“肾精”的实质与作用是目前研究的一个热点方向[44],由于传统中医理论本身重整体轻微观的原因,从干细胞领域研究中医基础理论的工作还刚刚起步。中医药“补肾”的机理目前还不清楚,它的用途非常广泛,是股骨头坏死整体辨证治疗的主要方法。补肾法对于中胚层来源组织(如骨、软骨及肌肉等)的损伤具有明显的促进修复作用,这种促进修复的作用与同样来源于中胚层的 MSCs的正常生理分化相类似。大量研究结果表明,补肾中药能促进M SCs体外增殖,诱导M SCs体外高效地向成骨细胞、成软骨细胞分化。补肾法诱导M SCs增殖与定向成骨分化是近年来一个新兴的研究领域,这对于进一步深入阐释中医药调控M SCs的机理以及从“以药验证”的角度阐释“肾主骨生髓”传统理论提供了新思路。

许春姣等[45]研究显示在M SCs诱导培养的早期,加入低浓度黄芪注射液,有利于促进 M SCs增殖和分化成骨,而长期高浓度则明显降低M SCs分化功能。王和鸣等[46]探讨巴戟天对大鼠 M SCs向成骨细胞分化影响,实验证实巴戟天能诱导 MSCs向成骨细胞分化,在经典成骨诱导组(地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠)中使用巴戟天含药血清培养,能显著促进 M SCs向成骨细胞分化。研究认为巴戟天中含有诱导M SCs成骨分化的化学成分,但究竟是哪种化学成分起作用,还有待以后的实验进一步证实。马慧萍等[47]研究淫羊藿总黄酮对大鼠M SCs增殖和成骨性分化的影响,将淫羊藿总黄酮和含淫羊藿总黄酮大鼠血清分别以不同浓度加入大鼠M SCs培养液中,进行细胞增殖和成骨分化的分析。实验表明淫羊藿总黄酮直接加入培养液对M SCs增殖无明显影响,含淫羊藿总黄酮大鼠血清则强烈刺激细胞增殖,成倍增加碱性磷酸酶染色阳性的克隆数;淫羊藿总黄酮不影响 M SCs的成骨分化,但淫羊藿总黄酮大鼠血清显著提高碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌量和钙盐沉积量。研究认为淫羊藿总黄酮活性代谢产物强烈刺激M SCs的增殖和成骨分化。史传道等[48]通过对补肾活血复方仙花活骨丹颗粒含药血清对小鼠M SCs激素诱导分化影响的观察,揭示该药物治疗激素性股骨头坏死药理学机制,研究发现仙花活骨丹含药血清可有效抑制地塞米松诱导的M SCs脂肪分化进程,提高其向成骨分化的能力。吴云刚等[49]将右归饮含药血清加入人M SCs诱导分化成骨细胞的培养体系,采用细胞形态学观察、M T T法及细胞内碱性磷酸酶含量检测反映其促进成骨的功能,结果表明右归饮对人成骨细胞的增殖起到促进作用,钙结节染色及细胞内碱性磷酸酶含量测定表明右归饮对成骨细胞的活性有促进作用。刘少军等[50]研究通络生骨胶囊对体外培养激素诱导M SCs成骨和成脂肪双向分化的影响,结果地塞米松可诱导M SCs成骨和成脂肪双向分化,通络生骨胶囊具有明显的抑制成脂肪分化,促进成骨分化的作用。研究认为通络生骨胶囊治疗激素性股骨头坏死药效机制,可能是通过对 M SCs成脂肪和成骨分化调控的影响而产生作用。

5 存在问题与展望

目前对M SCs及其在股骨头坏死修复中的研究虽然已取得了较大进展,M SCs在临床医学上的应用价值也已得到了肯定,但仍有许多问题有待解决。a)M SCs诱导分化的信号转导机制还不是很明确,多种诱导调控因素之间的相互作用也未完全阐明,还需要进一步探索。b)目前对于从干细胞角度探讨股骨头坏死病理机制的研究还仅限于由 M SCs向成骨细胞、脂肪细胞或血管内皮细胞分化这一环节上,而造血干细胞对于骨坏死的影响尚缺乏关注,坏死各阶段的病理过程还可以在干细胞水平做更为深入的研究。c)在成骨的过程中,MSCs细胞间如何作用以及其所处的微环境中各种刺激因子如何起作用,植入后的 M SCs所形成的新生骨在组织学、生物力学上与正常骨有多大差别,能否解决退变等问题也尚待研究。d)目前组织工程支架材料还处于研发阶段,且价格昂贵,技术尚未成熟,在临床上的应用有待于进一步的验证。e)MSCs移植治疗股骨头坏死的疗效缺乏长期随访及大样本随机对照研究,疗效评价标准和适应证的选择缺乏统一的标准。f)移植M SCs的适宜细胞量仍不清楚,移植途径究竟是直接移植好还是经血管移植好,还是两者联合使用更好,目前也缺乏研究报道。

M SCs具有强大增殖能力和多向分化潜能,其来源不受限制,取材方便,对供体损伤小,易于分离,大量传代后仍能保持其生物学特性。中药在 MSCs的扩增、定向分化的调控方面都有其独特的作用,既可直接作用于M SCs,又可影响其微环境,促进其存活与功能的建立。基于上述原因,将中药结合M SCs治疗股骨头坏死预示着良好的前景。但是目前的研究多仅限于动物实验,从人体实验方面研究中药对于M SCs的干预作用尚鲜见报道。目前有关M SCs的药物研究报道主要是基于对治病机理的反推求证,虽然大量临床研究结果显示单纯药物治疗不能改变坏死股骨头的塌陷变形,但是对坏死的自身修复作用是有确切帮助的。运用干细胞技术研究中医药对股骨头坏死的作用,也许可以使药物的作用机理更加明确,从而筛选出有效的治疗药物。因此,如何发挥中医药治疗股骨头坏死的独特优势,从细胞水、分子和基因水平探讨中药结合 M SCs治疗股骨头坏死药理学机制,进而过渡到人体实验,具有积极重要的意义。

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