3种中草药对克氏原螯虾血清溶血活性、凝集活性的影响

许巧情，黄 翠(长江大学动物科学学院，湖北荆州434025）

赵朝阳，周 鑫(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种与养殖生物学重点开放实验室，江苏无锡214081）

近年来，克氏原螯虾(Procambarusclarkii）在全国各地人工养殖方兴未艾。据统计，仅湖北省荆州地区养殖克氏原螯虾的水面就已经达到数万公顷。但随着人工养殖面积的迅速扩大，病害的发生也越来越频繁和严重。国内已相继报道了克氏原螯虾的螺原体病、烂鳃病等疾病[1]，这些疾病已经给克氏原螯虾养殖者带来了重大经济损失[2，3]。传统上治疗和预防克氏原螯虾疾病主要依赖抗生素、化学药物等，但这些药物滥用造成的环境污染、药物残留、病菌的耐药性等问题已严重困扰克氏原螯虾的养殖，而提高机体免疫力是进行疾病防治的基础，因此加强对克氏原螯虾免疫机能的研究尤为重要。

甲壳动物机体的免疫防御功能主要依赖于血细胞的吞噬、包掩等细胞免疫反应，其体液中不具有免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应，体液免疫主要是指血淋巴中的一些酶和调节因子，如酚氧化酶原激活系统、溶血素、凝集素、溶菌酶、蛋白酶抑制剂等。凝集素是一种能使细菌、脊椎动物的红细胞、某些寄生虫等发生凝集的因子，它实际上是一个蛋白质家族，具有结构异质性和异物结合位点的特异性，对热不稳定(56℃15min即可失活），其活性需Ca2＋激活。它的作用类似于脊椎动物的抗体，是甲壳动物体内的一种免疫识别因子[4-6]。中草药具有补充营养，提高机体的特异性和非特异性免疫力的功能；具有抗菌、抑制病毒等方面的作用[7]。目前，关于中草药对甲壳动物凝集素的影响报道较少，而有关中草药对克氏原螯虾凝集素影响的研究尚未见报道。因此，通过对克氏原螯虾血清溶血素、凝集活性的测定及进一步研究，筛选促进生长和调节克氏原螯虾非特异性免疫功能的中草药免疫调节剂，可进一步为克氏原螯虾免疫应答机理研究和提高其抗病能力提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 材料

克氏原螯虾购于湖北省荆州市钟鼓楼市场；陈皮、甘草、淫羊藿3种中草药购于湖北省荆州市同济大药房；虾饲料由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心提供；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus）、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus）、大肠杆菌(Escherichiacoli）、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila）均由长江大学动物科学学院微生物实验室提供。陈皮、淫羊藿和甘草的有效成分采用醇提法提取后[8]，分别添加到饲料中。

1．2 试验方法

试验选用同批次、健康、规格相近的克氏原螯虾700多只，随机分为4组，其中对照组只投喂虾饲料原料，其余3组为试验组，分别投喂添加了陈皮、淫羊藿、甘草的虾饲料。每组设置9个重复，每个重复的水箱中放养20只克氏原螯虾。试验期间，所有试验虾分别养于36只完全相同的室内水箱中，室内温度20～26℃，管理条件一致。以制备的3种中草药添加剂饲料和饲料原料进行投喂，每天定时、定点、定量投喂。整个饲养过程中，按克氏原螯虾常规饲养管理进行。在投喂后第7、14、21、28天分别取样测定血清中的溶血素含量和凝集活性。

1．3 血清的制备

将克氏原螯虾的头胸甲打开，拨开2片鳃叶，把覆盖在心脏上方的薄膜轻轻跳开，露出心脏，再从心脏部位抽取血淋巴，于室温静置2～3h，以移液枪采取血清。

1．4 鸡红细胞悬液的制备

先采集新鲜鸡血，用Alsever's液保存，3000r／min离心15min后，再加0．85%灭菌生理盐水洗涤2次以除去Alsever's液，最后用0．85%灭菌生理盐水分别配成体积分数为3%和5%的鸡红细胞悬液，4℃冰箱保存备用。

1．5 克氏原螯虾血清溶血活性的测定

参照文献 [4]的方法测定。取2．5ml体积分数为3%的鸡红细胞悬液与0．1ml虾血清混合均匀，每个样品重复3次，25℃保温1h。在对照管中加入2．5ml体积分数为3%的鸡红细胞悬液和0．1ml 0．85%灭菌生理盐水，与试验管同时保温，取出后立即冰浴以终止反应，经1500r／min离心15min后获得上清液。以对照管上清液作空白，于752型分光光度计540nm处测光密度。

1．6 克氏原螯虾血清凝集红细胞活性的测定

测定方法采用分光光度法[9]。将克氏原虾血清按照倍比稀释方法进行稀释，取体积分数为5%的鸡红细胞2．5ml分别加入稀释后的血清中。置于25℃保温40min后，测定波长600nm处的光密度。最终血清效价为能与鸡红细胞发生明显凝集反应的最高稀释度的倒数，即测得吸光度越低，则凝集活性越明显。

1．7 数据处理

试验数据采用SPSS 15．0软件进行方差分析，结果以平均数±标准差(mean±SD）表示。

2 结果与分析

2．1 3种中草药对克氏原螯虾血清溶血活性的影响

由表1可知，投喂28d后，淫羊藿组的克氏原螯虾血清溶血活性平均值为0．806，且与对照组之间差异极显著(P＜0．01）；而甘草组的克氏原螯虾血清溶血活性平均值为0．527，与对照组之间差异显著（P＜0．05）；陈皮组的克氏原螯虾血清溶血活性平均值为0．372，与对照组之间没有明显的差异(P＞0．05）。

表1 投喂不同时间后各组克氏原螯虾血清的溶血活性

2．2 3种中草药对克氏原螯虾血清凝集红细胞活性的凝集效价的影响

由表2可知，投喂28d后，淫羊藿组和甘草组的凝集效价明显高于对照组，饲喂7d后的甘草组和淫羊藿组，其凝集效价分别达到13．33和10．67，明显高于对照组，在随后的第14、21、28天的3次取样中淫羊藿组和甘草组凝集活性不断上升，淫羊藿组在第28d时达到26．67，甘草组达到53．33。统计结果表明：与对照组相比，淫羊藿组和甘草组均有显著的提高(P＜0．05），而陈皮组差异不显著(P＞0．05）。

表2 投喂不同时间后各组克氏原螯虾血清凝集红细胞活性的凝集效价

3 讨论与小结

溶血素是无脊椎动物免疫防御系统中的一种重要的非特异性免疫因子，其作用类似于脊椎动物的补体系统，可以溶解异物细胞，参与调理作用。无脊椎动物的溶血素与脊椎动物血细胞表面的特异性糖链结合后，破裂细胞膜造成溶血现象。溶血素活性的高低反应了机体识别和排除异种细胞能力的大小。研究表明：加州美对虾(Farfantepenaeuscaliforniensis）、日本对虾(Marsupenaeusjaponicus）和中国对虾(Fenneropenaeuschinensis）血淋巴中存在溶血素表现出对鸡红细胞、人B型血细胞和鼠红细胞的溶血活性。溶血活性大小与对虾的体质有密切关系，可以用作评价对虾健康状况的指标[10]。日本对虾血淋巴液对鸡红细胞具有一定的溶血作用，而濒死对虾的溶血活性大大降低[11]，这说明溶血素与对虾的体质有密切关系。本试验结果表明，连续投喂中草药，可引起克氏原螯虾血清中溶血活性增加，从而提高其免疫能力，这与对日本对虾的研究一致，日本对虾经注射虫草多糖刺激后，溶血素活性大大增强，24h时溶血活性即比对照组高出48%，至72h时溶血活性达到最高[11]。

凝集素在无脊椎动物血液中的重要作用是起选择凝集作用，是免疫防御的重要体液因子之一，涉及一些水生动物的幼体附着和变态行为。如多毛类动物石灰虫(Calcarinasp．）体内产生的凝集素能识别海生假单胞菌外聚物中的葡萄糖，并与之结合，诱导石灰虫幼体附着和变态行为[12]。到目前为止，许多甲壳动物体内已发现有凝集素的存在[4]，它们对多种脊椎动物的红细胞均有凝集作用。其中家兔红细胞对甲壳动物的凝集素最为敏感，斑纹蟳(Charybdiscruciata）、红星梭子蟹(Portunussanguinolentus）、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus）、华溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense）、锯缘青蟹（Scyllaserrata）与兔红细胞凝集活性最强，血清凝集活力均为211[5]；南美白对虾(Penaeusvannamei）对家兔红细胞的凝集作用最强，凝集效价为212，其次为家鸽，为25，家鸡22，对鹌鹑红细胞的凝集活力仅为20，而对人的A、B、O血型及山羊(Caprahircus）、家鸭(Anasdomestica）、水蛇（Enhydrischinensis）、牛蛙(Ranacatesbeiana）、鲫鱼(Carassiusauratus）8 种红细胞无凝集作用[13]。

凝集素具有可诱导性，给水产无脊椎动物注入抗原或当无脊椎动物受到损伤时，其体内凝集素活性发生明显改变。例如给日本对虾注射细菌后，其血淋巴凝集活力发生明显变化[12]。用弧菌诱导过的中国对虾，凝集素凝集活力明显增强，而在己发病的病虾体中的凝集素活力下降[14]。本试验结果表明，以3种中草药连续投喂克氏原螯虾1个月后其凝集活性明显提高，这说明中草药能提高克氏原螯虾非特异性免疫能力。无独有偶，采用添加0．5%和1．0%的复方中草药投喂河蟹(Eriocheirsinensis），其血清的凝集效价均得到了显著的提高[15]。

凝集素存在的部位在不同的生物中存在差异。早在1982年，Vasta[16]曾在美洲巨蛎(Crassostrea virginica）的血清中发现有2种血细胞凝集素：一种游离存在于牡蛎的血清中，另一种可以牢固地吸附在牡蛎血细胞的细胞膜上，这种细胞膜结合型的血细胞凝集素能够凝集马、猫、小鼠等多种动物的血细胞，推断这种细胞膜结合型的凝集素可能会在异物识别中提供受体位点，以促进牡蛎血细胞同外源异物间的结合，从而有利于异物的排除，增强了免疫功能。但在中国对虾血细胞的细胞膜上没有发现凝集因子的存在，说明中国对虾的血细胞凝集素可能仅仅游离并存在于血淋巴液中，而未与血细胞发生吸附[17]。

凝集素活性的测定方法常见的有2种，一种是通过凝集素与新鲜的或经甲醛、戊二醛固定的动物红细胞凝集反应的效价来测定，另一种是用分光光度法测定[12]。第一种方法是利用 “双倍系列稀释法”通过肉眼观察试验结果，因而测量误差较大。而且有时会导致试验失败，例如牟海津等[17]采用 “双倍系列稀释法”研究中国对虾血细胞膜制品对鸡、小鼠、兔等动物的血红细胞进行凝集试验时，均未发现有凝集现象的发生。而分光光度法是利用凝集素与红细胞相互作用后，凝集的红细胞下降快的原理，测定上清的光密度值[9]。本试验也据此原理测定克氏原螯虾血清凝集红细胞活性，得到了较好的结果，也证明分光光度法效果相对较好。

陈皮、甘草、淫羊藿3种中草药能够诱导克氏原螯虾溶血素和凝集素的产生，提高溶血素和凝集素在血淋巴液中的浓度，从而增强克氏原螯虾的免疫功能。因此，在克氏原螯虾养殖中，使用陈皮、甘草、淫羊藿等免疫增强药物，有望对增强克氏原螯虾的体质、减少病害的发生起到一定的作用。

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