甘油脱水酶的研究进展

王庆花,方柏山

(1.华侨大学化工学院,福建泉州 362021; 2.厦门大学化学化工学院,福建厦门 361005)

甘油脱水酶的研究进展

王庆花1,方柏山2

(1.华侨大学化工学院,福建泉州 362021; 2.厦门大学化学化工学院,福建厦门 361005)

甘油脱水酶是微生物发酵法生产3-羟基丙醛和1,3-丙二醇过程中的关键限速酶.文中对甘油脱水酶的结构与功能、作用机制、基因工程研究等情况进行综述,探讨了甘油脱水酶的研究进展并提出一些建议.

甘油脱水酶;生物转化法;结构功能;作用机制;基因工程

1,3-丙二醇(1,3-PD)作为合成具有优良性质的聚酯和聚氨酯的单体,被认为是本世纪具有广阔应用前景的化工原料.近年来,生物转化法以其利用可再生资源、清洁生产、环境友好型、有利于可持续发展,逐渐成为国内外研究热点.目前,已发现了多种能以甘油为底物发酵生产1,3-PD的菌种,但还没有发现可以利用其他有机物质为底物进行生产的天然菌[1].甘油脱水酶(Glycerol Dehydratase, GDHt)是催化甘油转化生成1,3-PD代谢途径中的关键性限速酶.克雷伯肺炎杆菌(K lebsiella pneumoniae)和丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)具有较高的1,3-PD转化率、甘油耐受力和生产强度,备受研究者关注.克雷伯肺炎杆菌编码的是一种依赖辅酶B12的甘油脱水酶,需要在培养基中额外加入价格昂贵的维生素B12.丁酸梭状芽孢杆菌属于严格厌氧菌,其培养条件苛刻,国内研究较少.由于丁酸梭状芽孢杆菌中甘油脱水酶不依赖辅酶[2-3],因而成为新的研究热点.本文主要综述甘油脱水酶(GDHt)的结构与功能、作用机制、基因工程等方面的研究进展.

1 甘油脱水酶的结构与功能

1.1 辅酶B12依赖型甘油脱水酶

辅酶B12依赖型 GDH t是由α,β,γ3个亚基组成的二聚体,其结构为(αβγ)2[4].辅酶依赖型 GDH t晶体结构中,辅酶B12依赖型的GDHt是α2β2γ26个亚基通过非共价键的疏水相互作用缔合成的异六聚体,其中两个αβγ异型三聚体组成了一个对二聚体.α亚基含一个由8个平行的β链构成的丙糖磷酸异构酶(TIM)桶状结构[5].这个β-桶状结构把活性中心围在中间,所以α亚基是甘油脱水酶最重要的活性中心,活性中心含有必需因子 K+的结合位点.维生素B12与 GDH t的结合需要 K+,而 K+的结合能够轻微改变 GDH t的空间构象,使其与辅酶结合得更紧密.维生素B12位于 TIM桶状结构和β亚基之间.K+离子、底物分子及辅酶的腺苷一侧只与α亚基结合.

底物的结合对酶分子构象产生的变化最大的是在β亚基,其前后倾斜了约3°[4,6].与底物结合后,与辅酶以氢键结合的残基增加了3个,并且键长都明显缩短.这样也导致Co-N键(Co与DB I部分的作用力)被拉长,而Co-N的键长关系到Co-C键的断裂方式(Co-N键的拉长可使Co-C键偏向均裂[7]).Co-C键的均裂是酶促反应的最开始的一步,也是必需的一步.

洪燕等[8-9]通过生物信息学软件分析,证明了β亚基是对辅酶B12失活非常重要的一个区域.GDH t的α亚基和β亚基均与辅酶B12结合,辅酶B12的脱氧酰苷基团朝向α亚基,而β亚基主要与辅酶的DB I部分结合.通过配体与蛋白质结合(Ligand Protein Contacts,LPC)分析,β亚基中有13个氨基酸残基与辅酶的DBI部分以氢键形式结合,底物结合时氢键键长都比未结合时短,作用面积增大,活性中心变窄,作用更强.陈永胜等[10]未检测到甘油脱水酶的单个亚基及亚基两两组合的酶活性,表明甘油脱水酶的单个亚基不能构成活性中心;而将3个亚基按等摩尔比在体外混合则能检测到较低酶活.据此推测,简单的混合未能形成合理的空间构象.

1.2 辅酶B12不依赖型甘油脱水酶

辅酶B12不依赖型 GDH t为一个单亚基二聚体结构[11].GDHt是一个由单亚基通过非共价键的疏水相互作用缔合成的二聚体,两个单体呈几乎完美的中心对称,其单体由10个β/α桶状结构组成,氨基酸C端作为高度保守区是与再激活酶结合的位点.

构成GDH t单体核心的是两组5个β-平行结构反向平行排成的桶状结构,其外围绕若干α-螺旋.这个β/α桶状结构与丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate Fo rmate-Lyase,PFL)和厌氧性核糖核苷酸还原酶(Anaerobic Ribonucleotide Reductase,ARNR)中的β/α桶状结构相似,底物甘油或1,2-丙二醇正是结合在这个桶状结构中.在此结构中,GDH t,PFL和ARNR外围α-螺旋的数量和位置有明显的不同,若取其10个β片状结构进行比对,其均方根偏差(RM SD)为68 nm;若比对区域包括这些外围α-螺旋,则均方根偏差大于80 nm,即相似性更低.

GDH t与PFL最保守的区域在C端,分别对应前者的氨基酸残基731～782和后者的702～754,其均方根偏差仅为7 nm.这个区域包括一个Gly自由基环、一个β-反向平行和4个α-螺旋,其中的两个α-螺旋位于酶的表面.当 GDH t以二聚体形式存在时,这个保守区域位于酶的两个相反方向的表面,经过对GDH t和PFL序列和结构进行比对,发现两者侧链氨基酸具有高度保守性.结晶分析发现,侧链的高保守甘氨酸残基都采用顺式构象,GDHt中的R782对应PFL中的R753是其中最保守的残基.从GDHt和PFL的晶体结构分析来看,这两个残基都从C端的α-螺旋向内延伸,从而与C链上距活性甘氨酸仅隔两个氨基酸的残基形成氢键.Jessica等[11]已通过对R782残基进行定点突变证明其参与了酶催化过程中的质子传递,因此有理由相信,前述C端保守区是GDH t与其再激活酶结合的位点.

2 甘油脱水酶的作用机制

辅酶依赖型GDHt的作用机制已研究得比较透彻,其依赖的辅酶有腺苷酰化钴铵素(Adenosylcobalamin)和甲基钴铵素(Methylcobalamin)两种形式.它们的生化作用不同,前者作为一个辅基辅助酶分子催化,而后者则作为催化甲基转移反应的酶分子的分子伴侣.

依赖腺苷酰化钴铵素的酶至少有两种与辅酶B12结合的模式,即:Base-On模式和Base-Off模式.前者是表示在结合过程中辅酶分子的DB I(5,6-二甲基苯并咪唑)部分与Co原子的化学键断裂,而原酶中的一个组氨酸残基取代其与Co原子结合;Base-Off模式是指这种取代不会发生,DB I部分依然与Co原子结合,而DB I部分与原酶中的一些氨基酸残基相结合维持其稳定性.Base-Off模式的典型代表即为依赖辅酶B12型甘油脱水酶(GDH t)和二醇脱水酶(DDH).

在 K+和如甘油等底物存在的条件下,辅酶B12与 GDHt结合,其Co-C键发生了均裂,产生一个5’-脱氧腺苷自由基团.这个腺苷基团是催化过程中关键的部分,它将甘油的C1原子上的H原子掠夺过来,自己转变成脱氧腺苷,而底物形成了一个甘油基团.与此同时,C2原子上的 H与C1原子上的OH交换,形成HOCH2-˙CH-CH(OH)2中间态.此物将H原子从5’-脱氧腺苷上夺回来后迅速脱水成为1,3-PD,5’-脱氧腺苷自由基,并与钴胺素结合重新生成维生素B12;然后,在第2个底物分子与GDH t结合后,重新可逆均裂,释放自由基团,进行催化.这所有的过程都被认为是在α亚基的TIM桶区域中进行[5].

Stubbe等[12]报道一类新型的酶.这类酶借助S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代替辅酶B12催化反应,称之为SAM依赖型酶[13].它们都含有一个与[4Fe-4S]基团相匹配的3～4个彼此间隔的半胱氨酸残基基团[14-15].尽管这类酶根据底物不同而需要不同的辅因子,但其催化机理相同[16].

3 甘油脱水酶的基因工程

3.1 甘油脱水酶的克隆表达与共表达

随着基因工程技术的发展,利用基因工程手段对酶分子进行改造越来越受到人们的青睐.目前,已有研究者在不同的菌体和载体中对各种来源的 GDHt进行了表达,国内的研究大多集中在辅酶依赖型GDH t[17-24].唐悦等[17]将巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)的甘油脱水酶基因导入大肠杆菌中并成功表达,用金属镍亲和层析及S-300H凝胶层析将重组蛋白进行分离纯化,所得纯酶的比活为71.01μkat·g-1.洪解放等[18]在大肠杆菌中表达了K.pneumoniae编码的甘油脱水酶基因,所得酶的最高活力为145.86μkat·(g·min)-1,实现了K.pneumoniae的dhaB在大肠杆菌中的高效表达.平丽英等[19]将罗伊乳酸杆菌(L actobacillus reuteri)的甘油脱水酶基因在大肠杆菌表达,比活力可达19. 00μkat·g-1,比野生型菌株提高了86.88%.杨仲丽等[20]将C.butyricum的甘油脱水酶基因导入大肠杆菌中并成功表达,酶活性比野生菌高6倍,比活力约为0.60 m kat·g-1.刘长江等[21-23]已经克隆出辅酶依赖型GDH t单个α亚基和整个三亚基甘油脱水酶基因序列,进行序列分析并构建了表达载体;周文广等[24]也做了类似研究.

在甘油代谢酶系共表达方面,国内研究者也做了大量工作.徐小琳等[25]从K.pneum oniaeXJPDLi基因组中克隆表达了编码甘油脱水酶的α,β,γ亚基的dhaB,dhaC和dhaE.DNA序列分析显示,α亚基的氨基酸残基 H13,S193,N359,E407和M515,亚基的N47,L150和V189跟以前报道的不同.将其在E.coliBL 21中共表达,SDS-PAGE显示3个亚基能够很好的表达.重组甘油脱水酶的活性达到48μkat· g-1,是野生菌种的3倍.王凤寰等[26]将dhaB,dhaT和gdrAB在E.coli中共表达,得到酶活很高的重组体,在分批发酵中消耗14.3 g·L-1甘油,产生8.6 g·L-1的1,3-PD,用yqhD取代dhaT的重组体产1,3-PD质量浓度为13.2 g·L-1.马正等[27]也做了类似的研究,所得 GDH t酶活为138.36μkat· g-1,于37℃培养30 h后,重组体消耗40 g·L-1甘油可产11.3 g·L-1的1,3-PD.

3.2 甘油脱水酶的定向进化

酶的体外定向进化(简称定向进化)是近些年兴起的改造酶分子的新策略.它是根据达尔文进化论,在人为创造的进化条件下,在试管中模拟自然进化机制(随机突变、基因重组和自然选择),定向选择出所需性质酶分子的一系列操作[28].目前,关于 GDHt的定向进化的文献报道也在逐年增加.洪燕等[29]通过LPC分析GDHt与维生素B12的结合位点,预测出对序列中的所有氨基酸残基定位突变后ΔG值小于0的所有突变可能;对其进行生物信息学研究,通过定点突变等实验手段在分子水平上研究 GDH t的酶学性质和作用机制与蛋白质一级序列之间的关系,从而定向进化出高活性的辅酶B12依赖型GDHt.齐向辉等[30]对K.pneumoniae中离甘油脱水酶活性位点19.3A和29.6A的两个位点进行饱和突变得到38个突变体,其中一个突变体β亚基的活性比野生菌种高8.3倍.

3.3 甘油脱水酶的理性设计及新酶的开发

Knietsch等[31]构建宏基因组文库,通过活性筛选和分子杂交,获得具有甘油脱水酶活性的克隆.经检验,其可被甘油造成自杀性失活,也可被再激活因子dhaFG复活,证明获得了新的甘油脱水酶基因.Tobimatsu等[32]通过理性设计将二醇脱水酶β和γ亚基的N端一部分嵌合到甘油脱水酶中.对所得嵌合酶酶学性质研究表明,短的N端序列可有效地改变酶的溶解性.黄日波等[33-34]采用一种简便快速的方法从经甘油富集培养的土样中提取出质量较好宏基因组DNA,克隆并表达出肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸菌和丁酸梭菌甘油脱水酶.通过同源建模构建了这3个甘油脱水酶的三维结构,并对其进行亚基之间杂合改组的理性设计.根据设计结果,通过基因交换的方法对甘油脱水酶大、中、小亚基进行了杂合,可得到6种异源亚基杂合酶,使本没有活力的来源于宏基因组的甘油脱水酶具有了活力,部分杂合酶的酸碱稳定性、热稳定性得到了明显的改善.

4 研究展望

对甘油脱水酶的研究主要集中在辅酶B12依赖型GDHt,而对辅酶B12不依赖型GDH t研究较少,还有许多研究方向需进一步探究.

首先,在酶的制备方面,由于辅酶B12依赖型GDH t易失活且激活剂相当昂贵,很少纯化成功;而辅酶B12不依赖型 GDHt较稳定且激活剂价格相对比较便宜,所以应对辅酶B12不依赖型 GDHt的酶学性质和分离纯化工艺进行深入研究.

其次,通过酶分子活性中心的改造,以期得到适应性强、酶活高、稳定性好的酶系,来适应不同反应体系.除了定向进化和理性设计外,还可以采用半理性设计[35]对酶分子进行改造,也可从酶蛋白序列出发,采用伪氨基酸组成预测其生物学特性[36]或构建调和序列[37]以获得新型 GDHt.

在新酶的开发方面,可以利用宏基因组的方法寻找新的甘油脱水酶基因,同时应大力筛选新的甘油脱水酶生产菌株.

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(责任编辑:陈志贤英文审校:刘源岗)

Recent Progress in Research of Glycerol Dehydratase

WANG Qing-hua1,FANG Bai-shan2
(1.College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China; (2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

Glycerol dehydratase(GDH t)is a key rate-limiting enzyme in the process of producing 3-hydroxyp ropionaldehyde(3-HPA)and 1,3-propanediol(1,3-PD)by microbial fermentation.In this paper,the research in the structure and functions,catalytic mechanism and genetic engineering of GDHt were reviewed.The research progresses of GDHt were also discussed and some suggestions were given in the end.

glycerol dehydratase;bio transformation;structure and functions;catalytic mechanism;genetic engineering

Q 556

A

1000-5013(2011)02-0125-05

2010-06-23

方柏山(1957-),男,教授,主要从事生物反应工程的研究.E-mail:fbs@xmu.edu.cn.

国家高技术研究发展(863)计划项目(2006AA 020103);国家自然科学基金资助项目(20446004, 20676048)