超声波辅助提取杜仲翅果桃叶珊瑚甙工艺优化

马 龙，姚 晗，孙兰萍，许 晖

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

超声波辅助提取杜仲翅果桃叶珊瑚甙工艺优化

马 龙，姚 晗，孙兰萍，许 晖

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

目的：研究超声波辅助提取杜仲翅果中桃叶珊瑚甙的较佳工艺条件，为杜仲翅果资源的综合开发利用提供参考。方法：在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken试验设计确定乙醇体积分数、超声波功率、提取时间及液料比等因素的最佳工艺条件。结果：超声波辅助提取杜仲翅果中桃叶珊瑚甙的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数72.1%、超声波功率300W，提取时间20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在该条件下杜仲翅果桃叶珊瑚甙的实际提取率为5.91%。在试验范围内各因素对桃叶珊瑚甙得率影响大小依次为乙醇体积分数＞料液比＞提取时间。结论：超声波辅助提取法能够较好地提取杜仲翅果桃叶珊瑚甙。

杜仲翅果；桃叶珊瑚甙；超声波辅助提取；响应曲面法

杜仲(Eucommia ulmoides Oilv.)多年生落叶乔木植物，杜仲科杜仲属，被列为国家二级重点保护植物，是我国特有的名贵经济树种和贵重的中药材[1]。桃叶珊瑚甙是一种环烯醚萜甙类化合物，具有护肝解毒[2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、抗衰老[5]、抗骨质疏松[6]及抗肿瘤[7]等众多药理活性，在杜仲中含量丰富，分布于杜仲各部位，张康健等[8]对杜仲中药用活性成分进行分析比较发现杜仲翅果是杜仲各部位中桃叶珊瑚甙含量最多的部位。

目前，桃叶珊瑚甙的传统提取方法多采用加热浸提法，但是桃叶珊瑚甙为C4去甲基环烯醚萜化合物，对热敏感，易氧化分解，高温和长时间加热都不利于其提取[9]。为了减少桃叶珊瑚甙在提取过程中由于温度造成的损失，一些学者尝试使用了超声波提取技术[10]、超临界CO2萃取技术[11]、酶法提取技术[12]、微波提取技术[13-14]等先进的提取技术从杜仲不同部位提取桃叶珊瑚甙，均取得了较好的提取效果。超声波辅助提取技术是一种新的提取分离技术，与传统提取方法相比具有高效、省时、节能等优点，现已广泛应用于天然产物的提取。考虑到杜仲翅果果仁周围紧密地包附有薄翅，难以分离，本实验直接以杜仲翅果为原料进行提取[15]，采用超声波辅助提取技术，利用响应曲面法对杜仲翅果中桃叶珊瑚甙的提取工艺进行研究，探讨较佳工艺流程，为杜仲翅果的开发利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

杜仲翅果(带壳粉碎，索氏抽提脱脂脱胶，60℃烘干，过40目筛备用) 陕西省略阳县杜仲开发中心。

桃叶珊瑚甙标准品 中国药品生物制品检定所；Epstahl试剂(对二甲氨基苯甲醛0.25g，冰醋酸50g，35%磷酸5g，水20mL)、石油醚、甲醇、乙醇、盐酸等均为分析纯。

752紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；JP300超声波萃取器 武汉嘉鹏电子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

杜仲翅果→粉碎→脱油脱胶→干燥→过筛→提取→过滤→提取液→测定含量

1.2.2 单因素试验

分别以乙醇体积分数、超声波功率、提取时间和液料比为因素进行单因素试验，考察各因素对杜仲翅果中桃叶珊瑚甙得率的影响，确定各因素的变化范围。

1.2.3 Box-Behnken试验设计

综合考虑单因素试验结果，选用乙醇体积分数、提取时间、液料比为试验因素，以杜仲翅果桃叶珊瑚甙得率为响应值，进行3因素3水平Box-Behnken试验，优化杜仲翅果桃叶珊瑚甙提取工艺参数。试验设计因素水平及编码见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平及编码Table 1 Factors and their levels in Box-Behnken experimental design

1.2.4 桃叶珊瑚甙含量的测定

1.2.4.1 桃叶珊瑚甙标准曲线的绘制[16]

精确称取桃叶珊瑚甙标准品5.4mg，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配成质量浓度0.54mg/mL的桃叶珊瑚苷甲醇标准溶液。分别吸取该溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL于10mL比色管中，依次加入1.7mL Epstahl试剂、0.5mL 20%盐酸、2.5mL 95%乙醇，加蒸馏水定容至刻度，在75℃水浴中显色20min，冷却10min后于波长596nm处测定其吸光度，以试剂空白作参比。桃叶珊瑚甙质量浓度(X，μg/mL)与吸光度(Y)的线性回归方程：Y=0.0161X＋0.0332，R2=0.9954。

1.2.4.2 样品中桃叶珊瑚甙含量的测定

准确吸取浓度适宜的样品溶液1.00mL于10mL比色管中，依次加入1.7mL Epstahl试剂、0.5mL 20%盐酸、2.5mL 95%乙醇，加蒸馏水定容至刻度，在75℃水浴中显色20min，冷却10min后，于波长596nm处测定其吸光度，以试剂空白作参比。对照桃叶珊瑚苷质量浓度测定的标准曲线，求得样品溶液中桃叶珊瑚苷质量浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取剂体积分数对提取效果的影响

称取经预处理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，分别加入体积分数0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇水溶液，在超声波功率300W条件下处理15min，测杜仲翅果中桃叶珊瑚甙得率。提取剂体积分数对得率的关系曲线如图1所示。

图1 提取剂体积分数对桃叶珊瑚甙得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of aucubin

从图1可以看出，当乙醇体积分数在0～70%范围内时，桃叶珊瑚甙的得率随乙醇体积分数的增加而升高，并在70%时达到最大值；乙醇体积分数超过70%时，得率开始大幅下降，而且提取液开始变浑浊，说明有较多醇溶性物质溶出，提取效果降低。因此选择较佳的乙醇水溶液体积分数为70%。

2.1.2 超声波功率对提取效果的影响

称取经预处理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，加入体积分数70%乙醇水溶液，分别在超声波功率60、120、180、240、300W条件下处理15min，测定杜仲翅果中桃叶珊瑚甙得率。超声波功率对得率的关系曲线如图2所示。

图2 超声波功率对桃叶珊瑚甙得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of aucubin

从图2可以看出，桃叶珊瑚甙得率随着超声波功率的增加而增加。这是因为超声波功率越大，所产生的空穴作用和机械搅拌作用越强烈，分子扩散速度也越大，桃叶珊瑚甙渗出就越快。由于本实验所使用的超声波萃取器的最大功率为300W，根据曲线趋势桃叶珊瑚甙的得率还可能继续增大，超声波功率300W并不一定是最佳条件，故超声波功率因素不带入Box-Behnken试验。

2.1.3 提取时间对提取效果的影响

称取经预处理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，加入体积分数70%乙醇水溶液，在超声波功率300W条件下分别处理10、20、30、40、50、60min，测定杜仲翅果中桃叶珊瑚甙得率。提取时间对得率的关系曲线如图3所示。

图3 提取时间对得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of aucubin

从图3可以看出，超声波处理20min的桃叶珊瑚甙得率明显高于处理10min的得率，这可能是由于超声波对杜仲翅果组织结构的破坏作用不断加大，溶出物多，得率也高；但是超声波处理超过20min后，桃叶珊瑚甙得率不但不再增加，反而显著下降，主要原因可能是随着提取时间的延长，溶液体系的溶质浓度逐渐达到了平衡，同时持续的超声波作用使溶出的部分桃叶珊瑚甙的分子结构遭到破坏。因此选取较佳的提取时间为20min。

2.1.4 液料比对提取效果的影响

称取经预处理的杜仲翅果粉1g，分别按液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，加入体积分数70%乙醇水溶液，在超声波功率300W的条件下处理20min，测定杜仲翅果中桃叶珊瑚甙得率。液料比对得率的关系曲线如图4所示。

图4 液料比对桃叶珊瑚甙得率的影响Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

从图4可知，随着溶剂用量的增加，桃叶珊瑚甙得率逐渐升高。当液料比在5∶1～15∶1范围内时，桃叶珊瑚甙得率上升较快；但当液料比超过15∶1时，得率增长趋势比较平缓，基本持平。这可能是因为超声波辅助提取实质上也是溶质萃取过程，根据扩散定律可知，随着溶剂用量的增加，杜仲翅果粉与溶剂接触面的浓度差增大，从而提高了溶质与溶剂的扩散速度，提取率增大；随着杜仲翅果粉中桃叶珊瑚甙的不断溶出，导致浓度差下降，扩散速度减小，逐渐达到平衡状态。由于杜仲翅果中桃叶珊瑚甙的含量是一定的，当溶剂用量过大时，会造成溶剂浪费，增加后续浓缩工序的负荷，基于降低生产成本考虑，因此选择较佳的液料比为15∶1 (mL/g)。

2.2 Box-Behnken试验设计结果与分析

2.2.1 回归模型的拟合与检验

Box-Behnken试验设计方案及结果、方差分析和参数估计及显著性分析分别见表2～4，试验按随机顺序进行。

运用Minitab15统计分析软件对表2中的试验结果进行多元回归拟合，获得桃叶珊瑚甙得率对乙醇体积分数、提取时间、液料比的二次多项回归模型方程：

Y=5.85＋0.25Xl＋0.10X2＋0.18X3-0.42Xl2-0.26X22-0.15X32-0.06XlX2-0.09XlX3＋0.01X2X3

表3表明，二次回归模型的F值=106.53＞F0.01(9,5)= 10.15及F0.05(9,5)= 4.77，相应的P＜0.0001，该方差的模型达到极其显著；而失拟项的F值=2.61＜F0.05(3,2)=19.16，其相应的P=0.289，表明失拟性差异不显著，该回归方差无失拟因素存在，符合模型要求。回归诊断结果说明该二次回归模型拟合效果很好，其决定系数r2=1.75/1.77=0.9887，具有高度的相关性，表明模型的实测值与预测值之间具有较好的拟合优度，故模型成立。

表2 Box-Behnken试验设计方案及响应值的实测值和预测值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding predicted and experimental values of extraction yield of aucubin

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the predictive model for extraction yield of aucubin

表4 回归方程参数估计及显著性分析Table 4 Coefficient estimate and significance of each term of the predictive model for extraction yield of aucubin

为利用二次多项式回归模型方程获得优化值，根据表4中回归方程参数显著性分析结果剔除未达到0.25以上显著水平的因素，得到修正后的回归方程为：

Y = 5.85 + 0.25Xl＋0.10X2＋0.18X3-0.42X12-0.26X22-0.15X32-0.06XlX2-0.09X1X3

修正后的二次回归模型的F值提高至137.77，失拟项的F值下降至2.06，决定系数r2提高至0.9946，故新的回归方程拟合效果进一步提高。

2.2.2 主效应分析

从表3和表4可以看出，一次项、二次项和交互项的X1X3对响应值有显著或极显著影响，即乙醇体积分数、提取时间、液料比和乙醇体积分数与液料比的交互作用对得率产生显著的影响。

回归方程参数显著性分析的t值可以反映出各因素对试验指标的重要性，∣t∣值越大，表明对试验指标的影响越大，即重要性越大。从表4可知，各试验因素的影响程度从大到小排列依次为：乙醇体积分数＞料液比＞提取时间。

2.2.3 响应面分析

图5 乙醇体积分数和提取时间对桃叶珊瑚甙得率的曲面图及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of ethanol concentration and extraction time on extraction yield of aucubin

多元回归方程的响应曲面图及及等高线图见图5～7。通过对该组动态图的分析即可对各因素及任意两因素之间的交互作用影响得率的效应进行评价。等高线图的形状可以反映出两因素间交互作用的强弱大小，椭圆形表示二者交互作用显著，而圆形则表示二者交互作用不显著。从图5和图7中可以直观地看出乙醇体积分数和提取时间、提取时间和液料比对杜仲翅果中桃叶珊瑚甙得率的交互作用不显著，与统计分析结果相符。从图6中可以看出乙醇体积分数和液料比对杜仲翅果中桃叶珊瑚甙得率的交互作用显著。

图6 乙醇体积分数和液料比对桃叶珊瑚甙得率的曲面图及等高线图Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of ethanol concentration and solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

图7 提取时间和液料比对桃叶珊瑚甙得率的曲面图及等高线图Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of extraction time and solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

2.2.4 二次多项式数学模型寻优与验证

对修正后的二次多项式数学模型方程解逆矩阵，得到杜仲翅果桃叶珊瑚甙的超声波辅助提取的较优最佳工艺参数为乙醇体积分数72.1%、提取时间20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在该工艺条件下得率的预测值为5.94%。

为了验证所得结论的正确性，选择响应曲面法优化所得到的工艺参数进行进行杜仲翅果桃叶珊瑚甙得率的对照试验，得率的实际值为5.91%，二者相对误差仅0.5%，说明试验优化得到的工艺参数基本是可靠的。

3 结 论

利用响应曲面法优化得到超声波辅助提取杜仲翅果桃叶珊瑚甙的较佳工艺参数为：乙醇体积分数72.1%、超声波功率300W、提取时间20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在该条件下，杜仲翅果桃叶珊瑚甙的提取率为5.91%。超声波辅助法提取杜仲翅果桃叶珊瑚甙具有收率高、节省溶剂、生产周期短、有效成分不易被破坏等优点，应用前景十分广阔。

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Process Optimization for Ultrasonic-assisted Extraction of Aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. Key Fruits

MA Long，YAO Han，SUN Lan-ping，XU Hui
(Department of Biotechnology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233000, China)

Objective∶ To optimize the conditions for ultrasonic-assisted extraction of aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. key fruits. Methods∶ One-factor-at-a-time method and response surface methodology based on Box-Behnken experimental design were used for process conditions optimization. Results∶ The optimal extraction conditions were 72.1% aqueous ethanol solution as the extraction solvent, ultrasonic power of 300 W, extraction time of 20.5 min and solid/liquid ratio of 12.3∶1 (mL/g). Under these conditions, the extraction yield of aucubin was observed to be 5.91%. Ethanol concentration had the largest impact on the extraction yield of aucubin, followed by solid/liquid ratio and extraction time. Conclusion∶ Ultrasonic assistance can enhance the extraction of aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. key fruits.

Eucommia ulmoides Oliv. key fruits；aucubin；ultrasonic wave-assisted extraction；response surface methodology

R284.2

A

1002-6630(2011)16-0080-05

2010-10-26

安徽省高等学校自然科学研究重点项目(KJ2011Z240)；安徽省高等学校省级食品科学与工程特色专业建设点资助项目(20101091)；安徽省食品科学与工程教学团队项目(20101094)

马龙(1979—)，男，讲师，硕士，研究方向为农产品加工与贮藏工程。E-mail：malongbb@163.com