外源Ca2+对盐胁迫下甜瓜叶片气孔开度的调节

王黎敏，黄丹枫，张屹东

（上海交通大学农业与生物学院，上海，200240）

外源Ca2+对盐胁迫下甜瓜叶片气孔开度的调节

王黎敏，黄丹枫，张屹东

（上海交通大学农业与生物学院，上海，200240）

研究了盐胁迫下甜瓜叶片气孔开度变化及外源Ca2+对甜瓜叶片气孔开度的调节作用。研究结果表明，盐胁迫下甜瓜叶片气孔开度显著增加，此变化是由NaCl促进气孔宽度增加引起的，而其对气孔长度无调节作用。同时，外源Ca2+对盐胁迫下的甜瓜气孔开度的调节也是反映在对气孔宽度的调节上，该调节效应受外界盐胁迫状况的影响。低浓度Ca2+（0.1 mmol/L）会促进盐胁迫诱导的气孔开放，高浓度的Ca2+（10 mmol/L）能抑制盐胁迫诱导的气孔开放，起缓解盐胁迫的作用。

甜瓜叶片；气孔；盐胁迫；外源Ca2+

全球7%的土壤深受盐渍化的影响，其中包括将近1/3的作物耕地面积。土壤的盐渍化严重降低了作物产量及品质，给农业生产带来很大的损失[1]。盐胁迫最大的为害是植物可利用水的亏缺，而植物散失的水分90%左右是经气孔排出的[2]，因此气孔的运动变化与植物抵抗盐胁迫密切相关。早期研究发现，外源NaCl处理可诱导植物气孔运动[3～4]。

Ca2+是多种信号途径的第二信使[5]，其参与CO2，水杨酸，脱落酸，过氧化氢诱导的气孔关闭，这些因子都会使得保卫细胞内质体内 Ca2+浓度（[Ca2+]cyt）上升[6～10]。若利用EGTA除去胞外Ca2+（[Ca2+] ext），会使得CO2、过氧化氢诱导的[Ca2+]cyt上升现象消失[6，11]。有趣的是，Ca2+还参与气孔开放。蓝光诱导的气孔开放会引起胞质Ca2+浓度的提高，然而，提高胞外Ca2+浓度会抑制蓝光诱导的气孔开放[12]。Ca2+在调节这些生物及非生物胁迫中所扮演的两面角色，使其研究热点经久不衰。近年来，Ca2+与植物耐盐性的关系引起了广泛的关注，越来越多的证据表明，Ca2+能缓解盐胁迫[13～14]，但关于Ca2+在盐胁迫下对植物气孔的调节主要集中在对蚕豆（Vicia faba）及拟南芥（Arabidopsis thaliana）保卫细胞的研究上，而到目前为止关于Ca2+对甜瓜保卫细胞的气孔调节的研究未有报道。甜瓜（Cucumis meloL.）具有喜肥耐盐特性，能适应的临界NaCl浓度达100～ 150 mmol/L，在0～100 mmol/L浓度内，甜瓜对NaCl胁迫有缓冲、调节、适应能力[15]。因此，本研究以网纹甜瓜（春丽）为试验材料，通过研究其在盐胁迫下的气孔特征变化，及外源Ca2+的调节作用，探讨盐胁迫下Ca2+对甜瓜叶片气孔调节的潜在生理功能，旨在服务于耐盐性作物的生产管理，为改善盐渍土壤的农业生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试品种为网纹甜瓜春丽1号（上海农业科学院园艺所提供）。种子进行简单消毒后，播种于培养土中，放在人工气候箱中培养，甜瓜生长的光／暗周期为12 h／12 h，光照强度为0.2～0.3 mmol·m-2·s-1，昼夜温度分别为（28±2）℃和（20±2）℃，相对湿度在60%左右，生长期间无胁迫。

1.2 试验方法

表皮条的生物分析参照Zhang等[16]的方法，取3～4周龄甜瓜苗顶端第3～4片完全展开的叶片，用蒸馏水洗净，撕下表皮，洗去叶肉细胞后，切成5 mm长的表皮条，暗处理3 h诱导气孔关闭。用10 mmol/L MES和10 mmol/L KCl（pH值5.6）开放缓冲液为对照，以缓冲液中加入NaCl（终浓度100，200 mmol/L）为盐胁迫处理，在此基础上施加CaCl2（终浓度0.1，1，10 mmol/L），同时在室温下，光照（0.2～0.3 mmol·m-2·s-1）3 h。每个处理至少用3个表皮条，每个表皮条随机测；每个视野随机取10个气孔器，然后在10×40倍倒置显微镜下用测微尺测定气孔长度、宽度，并计算气孔开口大小（长×宽）。测量气孔器中哑铃形体的长度为气孔长度，垂直于哑铃形体气孔器的最宽值为气孔宽度。

1.3 数据处理

利用Excel软件统计平均值和标准误差，并作图，用SAS 9.1统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下甜瓜叶片气孔开度变化

如图1所示，与未处理相比，100，200 mmol/L NaCl处理后，甜瓜叶片气孔开度分别增加了103.25%，50.28%，说明盐胁迫明显促进甜瓜叶片气孔开放。但NaCl胁迫对甜瓜叶片气孔开度的影响，主要表现为对气孔宽度的调节，而对气孔长度无调节作用。

图1 不同盐处理对甜瓜叶片气孔长度、宽度及开口大小的影响

图2 外源Ca2+对盐胁迫下甜瓜叶片气孔开口大小的调节

图3 外源Ca2+对盐胁迫下甜瓜叶片气孔宽度的调节

图4 外源Ca2+对盐胁迫下甜瓜叶片气孔长度的调节

2.2 外源Ca2+对盐胁迫下甜瓜叶片气孔开度的调节

盐胁迫下，甜瓜叶片气孔显著受外源Ca2+调节，且调节效应与盐处理浓度有关（图2）。100 mmol/L NaCl胁迫下，低浓度的Ca2+（0.1 mmol/L CaCl2）可有效促进 NaCl诱导的气孔开放，而中浓度的 Ca2+（1 mmol/L CaCl2）显著抑制NaCl诱导的气孔开放，使其开口减小25.33%，高浓度Ca2+（10 mmol/L Ca-Cl2）抑制效果则更加明显。200 mmol/L NaCl胁迫下，低浓度的Ca2+（0.1 mmol/L CaCl2）仍促进NaCl诱导的气孔开放，但此时中浓度的Ca2+（1 mmol/L CaCl2）也促进气孔开放，使其开口增大17.56%，当浓度达到10 mmol/L时，则显著抑制NaCl诱导的气孔开放。

2.3 外源Ca2+对盐胁迫下的甜瓜叶片气孔宽度及长度的调节

盐胁迫下Ca2+对甜瓜叶片气孔开度的调节主要体现在对气孔宽度的调节，二者变化趋势一致（图3）。100 mmol/L和200 mmol/L NaCl胁迫下，低浓度的Ca2+（0.1 mmol/L CaCl2）都可有效促进NaCl诱导的气孔宽度增加，高浓度Ca2+（10 mmol/L Ca-Cl2）显著抑制NaCl诱导的气孔宽度增加。而中浓度Ca2+（1 mmol/L CaCl2）显著抑制100 mmol/L NaCl诱导的气孔开放，使其宽度减小25.78%，却有效促进200 mmol/L NaCl诱导的气孔宽度增加，使其宽度增加15.72%。

如图4所示，NaCl胁迫下，不同Ca2+处理后甜瓜叶片气孔长度无显著变化，说明甜瓜叶片气孔长度不受外界Ca2+的调节，且与外界盐胁迫浓度无关。

3 小结与讨论

本研究通过对甜瓜叶片的表皮条生物分析，证明在NaCl胁迫下，Na+主要通过增加甜瓜叶片气孔的宽度，来诱导气孔开放。除此之外，从图1我们可以看出，100 mmol/L Na+诱导的气孔宽度增加幅度大于200 mmol/L Na+处理。气孔开放主要是靠K+的吸收来调节保卫细胞渗透势，迫使其开放[17]。而此试验中，Na+同样也能诱导气孔开放，说明Na+可代替K+，向胞内运输，诱导气孔开放。至于Na+通过何种途径进入保卫细胞内，目前学术界存在2种争论，一是Na+通过内向K+离子通道与K+竞争进入保卫细胞内[18]，二是通过外向K+离子通道进入保卫细胞内[4]。但Na+诱导的气孔开放可能会造成细胞内水分过多散失，从而不利于植物生长。

Ca2+作为公认的植物细胞第二信使，参与植物各种胁迫应答过程。非盐胁迫下，较高浓度的胞外Ca2+（2～10 mmo/L）可以诱导气孔关闭造成气孔导度下降，而高浓度的胞外Ca2+（10 mmol/L）会显著抑制盐胁迫下所诱导的蚕豆气孔开放[3，20，21]。本研究在甜瓜叶片中得到相似的结果，并且发现外源Ca2+对叶片气孔的调节与外界盐浓度有关，如施加1 mmol/L胞外Ca2+在100 mmol/L盐胁迫下促进气孔开放，而在200 mmol/L盐胁迫下，抑制气孔开放（图2）。高浓度的胞外Ca2+（10 mmol/L）在减少盐胁迫下水分散失的同时，还可能使气孔因过度关闭而影响其对CO2的吸收，进而影响光合作用。如图2，100 mmol/L盐胁迫下，10 mmol/L Ca2+时甜瓜叶片气孔开度为20.14 μm2，显著小于非盐胁迫下的气孔开度（26.94 μm2），此时就可能导致光合作用受阻。然而在200 mmol/L盐胁迫，10 mmol/L Ca2+处理下，甜瓜叶片气孔开度为27.13 μm2，刚好和非盐胁迫下的气孔开度保持同一水平，说明此浓度下的Ca2+既能缓解盐胁迫下的水分散失，又能保证甜瓜叶片进行正常的光合作用。

因此，在盐渍土壤的生产实践中，依土壤的含盐量状况适当施加Ca2+以调节植物气孔的形态特征，一方面可以防止因气孔开口过大引起水分过度蒸腾而导致对植物的伤害，另一方面又可以确保CO2从气孔进入细胞内维持植物正常的光合作用。

[1]Shabala S,Cuin Tracey A.Potassium transport and plant salt tolerance[J].PhysiologiaPlantarum,2007,133(4):651-669.

[2]李合生．现代植物生理学[M].北京：高等教育出版社，2002：164-174.

[3]赵翔，汪延良，王亚静，等.盐胁迫条件下外源Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜K+通道的调控[J].作物学报，2008，34（11）：1 970-1 976.

[4]Anne A V,Michael F R,Terry A M,et al.Guard cell cation channels are involved in Na+-induced stomatal closure in a halophyte[J].ThePlantJournal,1998,14（5）:509-521.

[5]陈玉玲，肖玉梅，王学臣.保卫细胞钙信号的研究进展[J].植物学通报，2003，20（2）：144-151.

[6]Webb A A R,MaAinsh M R,Mansfield TA,et al.Carbon dioxide induces increases in guard cell cytosolic free calcium[J].ThePlantJournal,1996,9:297-304.

[7]刘新，孟繁霞，张蜀秋，等.Ca2+参与水杨酸诱导蚕豆气孔运动时的信号转导[J].植物生理与分子生物学学报，2003，29（1）：59-64.

[8]DeSliva D L R,Hetherington A M,Mansfield T A.Synergism between calcium ions and abscisic acid in preventing stomatal opening[J].New Phytol,1985,100:473-482.

[9]Gilroy S,Read N D,Trewavas A J.Elevation of cytoplasmic Ca2+by caged calcium or caged inositol triphosphate initiates stomatal close[J].Nature,1990,346:769-771.

[10]Zhang X,Dong F C,Gao J F,et al.Hydrogen peroxide induced changes in intracellular pH of guard cells precede stomatal closure[J].Cell Research,2001,11(1):37-43.

[11]Pei Z M,Murata Y,Benning G,et al.Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells[J].Nature,2000,406:731-734.

[12]Julian I Schroeder,Gethyn J Allen,Veronique Hugouvieux,et al.Guard cell signal transduction[J].Plant physiol,2001,52:627-628.

[13]Collins R P,Harris P J C,Bateman M J,et al.Effect of calcium and potassium nutrition on yield,ion content,and salt tolerance of Brassica campestris(rapa)[J].Journal of Plant Nutrition,2008,31(8):1 461-1 481.

[14]Razzaque M A,Talukder N M,Dutta R K,et al.Efficacy of supplemental calcium on the growth of three rice genotypes differing salt tolerance[J].Journal of Plant Nutrition, 2010,33(4):571-586.

[15]谢亚丽，张屹东，季凯莉，等.转甜瓜钾离子通道基因MIRK拟南芥植株的耐盐性分析[J].上海交通大学学报：农业科学版，2009，27（5）：441-447.

[16]Zhang X,Zhang L,Dong F C,et al.Hydrogen peroxide is involved in abscisic acid-induced stomatal closure in Vicia faba[J].Plant Physiol,2001,126:1438-1448.

[17]Humble,G D,Raschke,K.Stomatal opening quantitavely related to potassium trasport[J].Plant Physiol,1971,48, 447-453.

[18]Schachtman D P.Molecular insights into structure and function of plant k+transport mechanisms[J].Biochimca et Biophysica Acta,2000,1465(1):127-139.

[19]张乃华，高辉远，邹琦.Ca2+缓解NaCl胁迫引起的玉米光合能力下降的作用[J].植物生态学报，2005，29（2）：324-330.

[20]McAinsh M R,Webb A A R,Taylor J E,et al.Stimulusinduced oscillations in guard cell cytoplasmic free calcium [J].Plant Cell,1995,7:1 207-1 219.

Effects of Exogenous Ca2+on Stomatal Morphological Character of Melon Leaf and Regulation under Salt Stress

WANG Limin,HUANG Danfeng,ZHANG Yidong
(School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiaotong Unversity,Shanghai 200240)

This study was focused on the response of stomatal morphological character of melon leaf when applying different exogenous Ca2+under salt stress.The results presented a significant augmentation in stomatal aperture caused by the promotion of stomatal width instead of length under salt stress.Meanwhile,the regulation of stomatal aperture by exogenous Ca2+under salt stress was also reflected in the width of the stomatal regulation,and influenced by the external salt condition.Low concentrations of Ca2+(0.1 mmol/L)will promote stomatal opening which was induced by salt stress,while high concentrations of Ca2+(10 mmol/L)inhibited stomatal opening induced by salt stress,and relieve the threat.

Melon leaf;Stomatal;Salt stress;Exogenous Ca2+

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.02.013

“上海市科技兴农推广项目”蔬菜生产基地高效栽培技术的集成示范（沪农科推字（2008）第4-1号）；甜瓜钾离子通道提高植物耐盐性的分子机理研究（09JC1408500）和上海市蔬菜学重点学科（B209）

王黎敏（1986-），女，硕士研究生，研究方向为蔬菜栽培与分子生物学，E-mail：wanglimin7700125@163.com

黄丹枫（1956-），女，通信作者，教授，博士生导师，E-mail：hdf@sjtu.edu.cn

2010-11-26