激光捕获显微切割技术在胃肠道肿瘤研究中的应用

邢 敬* 综述 陈晓宇 审校

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所（200001）

人体组织是由多种细胞组成的复杂结构，实体瘤组织如胃肠道肿瘤不仅包含肿瘤细胞（实质成分），还包含其他多种类型的细胞和基质（间质成分），如各种炎性细胞、纤维结缔组织等，因此通过直接研磨组织块提取DNA、RNA、蛋白质等进行研究并不能确切反映肿瘤的生物学特性。随着分子生物学研究的进展而出现的芯片技术、肿瘤基因组学、蛋白质组学等高通量分析均需获取单一纯净的细胞。虽然细胞培养可解决组织异质性问题，但体外培养的细胞脱离了体内环境，缺乏细胞间的相互作用和神经内分泌调节，不能完全反映细胞在体内的真实情况。此外，体外培养的肿瘤细胞株多源自中晚期癌细胞，无法反映肿瘤发生早期的分子生物学特点。

激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）技术是一种在显微镜直视下，通过激光捕获和切割从异质性组织中获得纯净目的细胞群或单个细胞的技术[1]。LCM系统最早于1996年由美国国立癌症研究所的Emmert-Buck等设计开发，并于次年实现商品化。该技术既解决了组织异质性问题，又不脱离体内环境，很好地满足了研究的需要，是连接病理学研究与分子生物学研究不可或缺的桥梁。迄今为止，LCM结合 PCR、RT-PCR、实时荧光定量 PCR、二维电泳（2-DE）、蛋白质印迹法、质谱法等多种技术，已在乳腺、前列腺、胃、结直肠等多种组织器官的研究中得到广泛应用。目前使用的LCM系统主要包括 Arcturus PixCell IIe、Zeiss PALM MicroBeam和Leica AS LMD三种，三者各有其优缺点。我国是胃癌高发地区，近年来结直肠癌的发病率亦逐渐升高。为此，本文对LCM的操作步骤及其与多种技术结合，在胃肠道肿瘤研究中的应用作一综述。

一、LCM的操作步骤

1.标本的制备和保存

冰冻组织的制备和保存：手术切除或活检标本获得后立即以OCT冰冻切片包埋剂包埋，液氮冷冻，-80℃冰箱干燥保存备用。如不预先包埋，后续切片时仍需行OCT包埋，笔者等在工作实践中发现这样可能会因组织冻融而影响研究结果。

石蜡包埋组织的制备和保存：所取组织块三个维度均不宜大于5 mm。以醛类为基础的固定剂，如甲醛溶液（福尔马林溶液）属于交联固定剂，可引起RNA降解，适用于DNA的分析，不适用于RNA和蛋白质的分析；以醇类为基础的固定剂，如Methacarn液属于蛋白沉淀固定剂，适用于RNA和蛋白质的分析。从石蜡包埋组织中提取得到的活性分子，数量和质量一般均低于冰冻组织[2]。由于常规病理标本多为甲醛固定石蜡包埋（FFPE）保存，有学者尝试从FFPE组织中提取RNA和蛋白质行基因芯片或定量蛋白质组学研究，结果显示可行[3,4]，其方法学仍有待进一步探讨。

2.切片的制备

冰冻切片的制备：冰冻切片机预先以75%乙醇擦拭、晾干，切片厚度以5～10μm为宜，不宜过厚。其中第一张切片行HE染色，用于病理诊断和显微切割时的对照（如包含目的细胞），明确切片上包含目的细胞后方可继续切片并固定于适当的载玻片上。如不立即行后续操作，切片可-80℃保存备用。

石蜡切片的制备：连续切片，厚度以10μm为宜。其中一张切片行HE染色用于病理诊断和显微切割时的对照，其余根据所使用的LCM系统固定于适当的载玻片上，常温保存备用。

3.切片的染色：用于RNA和蛋白质分析的冰冻切片染色前需预先在70%乙醇中固定0.5～1 min。用于辨别显微切割目的细胞的染色方法多样，包括甲基绿、甲苯胺蓝、苏木精、HE、AB-PAS、免疫组化染色等，可根据需要选用。然而在染色过程中，细胞中的RNA或蛋白质可能会被破坏，从而影响后续实验结果。有研究[5]探讨了不同染色方法对冰冻切片中小鼠浆细胞瘤细胞RNA的影响，发现甲基绿染色对RNA的影响最小，其次为HE染色和免疫荧光染色，Nissl染色影响最大。单独苏木精染色对蛋白质的影响较小[6]。笔者等曾尝试对冰冻切片行快速HE染色，显微切割后提取DNA、RNA和蛋白质进行研究，取得良好效果。

4.目的细胞的切割：各类LCM系统的组成大致包括显微镜、固态近红外激光二极管、激光控制器、控制显微镜载物台的操纵杆、CCD照相机、彩色监视器等。显微镜通常与个人电脑连接，用于激光的控制和图像的保存。首先将切片置于显微镜载物台上。以Arcturus PixCell IIe LCM系统为例，操作需在显微镜直视下进行，根据形态学或免疫组化染色选择目的细胞，以装有乙烯乙酸乙烯（EVA）聚合物膜的塑料转移帽覆盖欲切割的区域，按下按钮发射近红外激光脉冲，瞬间使目的细胞上不耐热的EVA膜融化并与目的细胞结合，移动操纵杆，将目的细胞从异质性组织中切割下来。每张切片的总捕获时间以不超过40 min为宜。Zeiss PALM MicroBeam LCM系统是以激光脉冲将目的细胞弹射进收集管中。Leica AS LMD LCM系统是以紫外激光脉冲将带有目的细胞的聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜切割下来，膜受重力作用落入收集管中。笔者等在使用Leica AS LMD LCM系统的过程中发现，由于静电吸引和空气扰动，切下的膜可能会吸附在切片背面或飘至别处，因此在切割时应注意防止这些因素的干扰。细胞收集完成后即可根据需要进行后续实验。如不立即进行后续实验，可将所收集的细胞置于EP管中，-80℃保存备用。有研究[7]显示，使用LCM系统（Arcturus PixCell）获得的胃癌细胞纯度如达到70%，其基因表达谱检测结果与非显微切割标本相比可存在明显差异，表明通过LCM技术获取纯净细胞进行研究，结果更为准确可信。

二、LCM结合多种技术在胃肠道肿瘤研究中的应用

1.DNA的分析：肠型胃癌的发生是一个多阶段、多步骤的过程，然而胃癌前病变的克隆状态及其与细胞增殖动力学的关系仍未完全阐明。Wang等[8]使用Arcturus Lcc1704 Veritas LCM系统，根据HE染色结果从FFPE组织中分离病变和正常胃黏膜上皮细胞，行人雄激素受体基因PCR以分析其克隆形成能力，结果显示单克隆起源率随肠化生、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变至肠型胃癌的多阶段癌变进程而逐级增高（16%、22%、69%和100%），在一定程度上与Ki-67的表达率相关，提示克隆状态的检测可能用于评估胃癌易感性。

目前认为大多数胃肠道间质瘤（GISTs）存在 c-kit或PDGFRA基因激活突变，两者突变在GIST发生早期其起源细胞Cajal间质细胞（ICCs）向肿瘤细胞转化的过程中起重要作用。Nakajima等[9]使用Arcturus PixCell II LCM系统，根据KIT免疫组化染色结果获得10例散发性GIST患者FFPE组织中GIST邻近区域的ICCs，通过PCR和直接DNA测序检测了两种基因的突变情况，发现无一例患者存在这两种基因突变，提示除c-kit和PDGFRA基因突变外，GIST的发生还可能与其他分子事件有关。

结直肠癌的发生除经典腺瘤-腺癌途径外，尚有de novo途径和锯齿状途径。研究发现BRAF基因突变与结直肠锯齿状病变显著相关，非锯齿状病变中该基因突变罕见，而KRAS基因突变主要与非锯齿状增生性息肉相关。增生性异型隐窝灶（ACF）是公认的结肠癌前病变，Rosenberg等[10]使用Veritas LCM系统从冰冻切片中分离ACF细胞，通过直接PCR测序检测了55个ACF样本中两种基因的突变情况，发现锯齿状与非锯齿状增生性ACF的BRAF突变率分别为63%和3%，组间差异有统计学意义，两组间KRAS突变率无明显差异（19%对42%），表明BRAF基因突变与锯齿状增生性ACF显著相关，该病变是结直肠癌锯齿状发生途径中的早期或可能的起始步骤。

微卫星不稳定（MSI）和杂合性缺失（LOH）与肿瘤的发生、发展相关。Roa等[11]使用Arcturus PixCell I LCM系统，根据甲基绿染色结果从94例胃癌活检标本石蜡包埋组织中的淋巴细胞（对照）、肠化生和胃癌区域获得相应细胞群，通过放射性标记PCR检测MSI和LOH发生情况，发现83%的胃癌和54%的肠化生中存在LOH，高级别MSI（MSIH）存在于11.7%的胃癌和17%与MSI-H表型胃癌相关的肠化生中，表明肠化生在遗传学上具有高度不稳定性。为验证MSI在胃黏膜肠化生上皮中频发的假说，Garay等[12]于胃癌高危地区收集了58例非胃癌肠化生（包括完全性和不完全性肠化生）个体的活检标本，使用Arcturus PixCell LCM系统，根据HE染色结果从乙醇固定石蜡包埋组织中取得化生上皮细胞，通过放射性标记PCR行MSI分析，结果显示无一例个体存在MSI，表明MSI在非胃癌个体的肠化生上皮中属罕发事件。

2.RNA的分析：RNA为基因表达产物，通过LCM技术获得纯净细胞行RNA分析能更准确地反映基因表达情况。既往观点认为转录因子RUNX3是胃抑癌基因编码产物。Friedrich等[13]联合使用LCM（Arcturus PixCell IIe LCM系统，FFPE组织切片，HE染色）和定量RT-PCR，发现胃黏膜上皮中RUNX3 mRNA表达水平极低，且不受肿瘤转化和幽门螺杆菌（H.pylori）感染的影响，胃间质中RUNX3 mRNA呈高表达，表达水平与H.pylori诱导的胃炎程度相关。鉴于RUNX3在胃黏膜上皮中低表达且在胃癌中未见表达下调，不支持RUNX3为胃抑癌基因的假说。

类肝素酶与肿瘤侵袭和血管生成相关。Wang等[14]的研究发现，如以常规组织标本行RT-PCR，所有胃癌原发灶、转移淋巴结和几乎所有配对正常胃黏膜组织中均可检测到类肝素酶转录水平的表达；如联合使用LCM（Arcturus LM200 LCM系统，冰冻切片，HE染色）和 RT-PCR，原发灶胃癌细胞和淋巴结转移细胞的类肝素酶表达率分别为47%和95%，配对正常胃黏膜上皮细胞中则无类肝素酶表达，原发灶胃癌细胞中的类肝素酶表达与肿瘤侵袭（Borrmann分型、胃壁浸润深度）和淋巴播散范围密切相关。该研究结果表明联合使用LCM与RT-PCR是进行分子水平分析的可靠方法。

目前关于胃肠道肿瘤遗传学改变的全面、准确的信息欠缺。Wu等[15]采用LCM（Arturus PixCell II LCM系统，冰冻切片，HistoGeneTMLCM Frozen Section Staining Kit染色）结合RNA线性扩增和cDNA微阵列技术检测胃癌基因表达谱，鉴定出504个能区分胃癌与非胃癌的基因，准确性高于99%。Wang等[16]采用LCM（Leica LCM系统，冰冻切片，甲苯胺蓝染色）结合cDNA微阵列技术比较正常胃组织、胃癌原发灶与转移淋巴结的差异基因表达谱，发现了四个在胃癌发生和转移中起关键作用的基因，其中OPCML、RNASE1、YES1的表达模式类似抑癌基因（原发灶中表达较正常组织下调，转移淋巴结中进一步下调），ACK1的表达模式类似原癌基因。后续以结肠癌为对象的研究证实上述基因在结肠癌中的表达模式与在胃癌中相同[17]，提示这些基因可能作为肿瘤侵袭、进展的生物学标记。

3.蛋白质的分析：通过LCM技术获得纯净细胞，结合2-DE、蛋白质印迹法、质谱法等技术的研究是寻找有价值的肿瘤蛋白质标记的重要途径。Zhang等[18]采用比较蛋白质组学方法，联合LCM（Leica LCM系统，冰冻切片，甲基绿染色）与SDS-PAGE、18O标记、nano-HPLC-MS/MS技术鉴别胃癌的生物学标记，发现与配对非癌胃黏膜上皮细胞相比，胃癌细胞中有42种蛋白表达上调，36种蛋白表达下调。 Cheng等[19]联合使用导航 LCM（Arcturus PixCellα LCM系统，冰冻切片，苏木精染色）与2-DE技术，对恶性与非恶性胃贲门上皮细胞进行了比较蛋白质组学研究，结果显示癌细胞中有15种蛋白表达上调，8种蛋白表达下调，其功能涉及代谢、分子伴侣、抗氧化、信号转导、细胞凋亡、细胞增殖和分化。上述发现有助于阐明胃癌发生的分子机制，并为胃癌的早期诊断和治疗提供可能的临床生物学标记和治疗靶点。

90%的结直肠癌死亡病例与原发肿瘤的转移扩散有关。Lin等[20]采用定量蛋白质组学方法，联合使用LCM（Arcturus PixCell IIe LCM系统，冰冻切片，核固红染色）与2-DE技术从980个蛋白中鉴别与结直肠癌淋巴结转移相关的分子标记，结果显示肌动蛋白结合蛋白transgelin是预测淋巴结转移的最佳候选生物学标记，ROC曲线下面积为0.868（P=0.002）。

确定肿瘤细胞的蛋白质信号通路激活状态，是进行肿瘤个体化生物靶向治疗时患者选择和分层的基础。Silvestri等[21]结合LCM（Arcturus Pixcell II系统，冰冻切片，HE染色）和反相蛋白质微阵列技术比较了结直肠癌标本癌细胞与肿瘤间质细胞中75种已知参与了肿瘤进展的蛋白质的磷酸化情况及其表达水平，发现两种细胞的蛋白质激活特征存在显著差异；非显微切割全组织样本与配对LCM样本相比，测得的蛋白质信号激活谱明显不同。该结果表明LCM技术对获取足量肿瘤细胞行蛋白质信号通路激活特征的检测具有重要意义。

三、展望

LCM技术于显微镜直视下获取纯净目的细胞，解决了组织异质性问题，与手工切割相比准确、方便、快捷，大大提高了后续研究的准确性，对于研究胃肠道肿瘤的发生、发展机制以及寻找新的诊断和治疗靶点具有重要意义。然而，目前LCM技术仍存在一些缺点和问题有待改进，如蜡块保存的组织易发生降解，从中提取RNA、蛋白质进行分析有一定难度，相关试剂盒有待开发；染色效果不尽理想，需具备丰富的病理学知识才能准确辨别目的细胞，且单纯根据形态学特征无法区分不同细胞亚型，需进一步开发辨别目的细胞的快速免疫组化和免疫荧光技术；获得的细胞总量较少，行蛋白质组学研究较为困难，需解决如何利用尽量少的细胞甚至单个细胞进行后续研究的问题。此外，笔者等在工作实践中发现显微切割足量的目的细胞需耗费大量时间和精力，亦给LCM技术的广泛应用带来很大阻碍。近年导航LCM、自动LCM等新技术陆续出现，从蜡块中提取生物大分子的试剂盒的研究以及通过免疫组化、免疫荧光技术辨别目的细胞的方法亦已取得一定进展。相信随着技术的进步，LCM作为一项具有独特优势的技术与其他多种技术相结合，将在胃肠道肿瘤和肿瘤学以及其他多个学科的研究中发挥更大作用。

1 Emmert-Buck MR,Bonner RF,Smith PD,et al.Laser capture microdissection.Science,1996,274(5289):998-1001.

2 Erickson HS,Gillespie JW,Emmert-Buck MR.Tissue microdissection.Methods Mol Biol,2008,424:433-448.

3 ScicchitanoMS,DalmasDA,BertiauxMA,etal.Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalinfixed,paraffin-embedded,and unfixed frozen tissue samples.J Histochem Cytochem,2006,54(11):1229-1237.

4 Ostasiewicz P,Zielinska DF,Mann M,et al.Proteome,phosphoproteome,and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.J Proteome Res,2010,9(7):3688-3700.

5 Wang H,Owens JD,Shih JH,et al.Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.BMC Genomics,2006,7:97.

6 Gutstein HB,Morris JS.Laser capture sampling and analytical issues in proteomics.Expert Rev Proteomics,2007,4(5):627-637.

7 Otsuka Y,Ichikawa Y,Kunisaki C,et al.Correlating purity by microdissection with gene expression in gastric cancer tissue.Scand J Clin Lab Invest,2007,67(4):367-379.

8 Wang L,Zheng L,Wang SY,et al.Clonal analysis of gastric carcinoma and precancerous lesions and its relation to Ki-67 protein expression.Neoplasma,2009,56(1):48-55.

9 Nakajima T,Miwa S,Ando T,et al.Interstitial cells of Cajal do not harbor c-kit or PDGFRA gene mutations in patients with sporadic gastrointestinal stromal tumors.J Gastroenterol,2009,44(5):426-431.

10 Rosenberg DW,Yang S,Pleau DC,et al.Mutations in BRAF and KRAS differentially distinguish serrated versus non-serrated hyperplastic aberrant crypt foci in humans.Cancer Res,2007,67(8):3551-3554.

11 Roa JC,Araya JC,Villaseca MA,et al.Microsatellite instability and loss of heterozygosity in neoplastic and preneoplastic gastric lesions (Article in Spanish).Rev Med Chil,2003,131(11):1227-1236.

12 Garay J,Bravo JC,Correa P,et al.Infrequency of microsatellite instability in complete and incomplete gastric intestinal metaplasia.Hum Pathol,2004,35(1):102-106.

13 Friedrich MJ,Rad R,Langer R,et al.Lack of RUNX3 regulation in human gastric cancer.J Pathol,2006,210(2):141-146.

14 Wang Z,Xu H,Jiang L,et al.Positive association of heparanase expression with tumor invasion and lymphatic metastasis in gastric carcinoma.Mod Pathol,2005,18(2):205-211.

15 Wu MS,Lin YS,Chang YT,et al.Gene expression profiling of gastric cancer by microarray combined with laser capture microdissection.World J Gastroenterol,2005,11(47):7405-7412.

16 Wang L,Zhu JS,Song MQ,et al.Comparison of gene expression profiles between primary tumor and metastatic lesions in gastric cancer patients using laser microdissection and cDNA microarray. World J Gastroenterol,2006,12(43):6949-6954.

17 Zhu JS,Guo H,Song MQ,et al.Gene profiles between non-invasive and invasivecolon cancerusinglaser microdissection and polypeptide analysis.World J Gastroenterol,2008,14(38):5887-5892.

18 Zhang Z,Li M,Zhang G,et al.Identification of human gastric carcinoma biomarkersby differentialprotein expression analysis using 18O labeling and nanoLC-MS/MS coupled with laser capture microdissection.Med Oncol,2010,27(2):296-303.

19 Cheng Y,Zhang J,Li Y,et al.Proteome analysis of human gastric cardia adenocarcinoma by laser capture microdissection.BMC Cancer,2007,7:191.

20 Lin Y,Buckhaults PJ,Lee JR,et al.Association of the actin-binding protein transgelin with lymph node metastasis in human colorectal cancer.Neoplasia,2009,11(9):864-873.

21 Silvestri A,Colombatti A,Calvert VS,et al.Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.Lab Invest,2010,90(5):787-796.