不同胃黏膜病变组织中诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达

李晓丽,林 锐,李建生,李继昌

1)郑州大学第一附属医院老年病科;河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院消化内科郑州 450052

△女,1977年2月生,硕士,主治医师,研究方向:消化道肿瘤,E-mail:lxl039921@sina.com

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的发生和发展是一个多基因、多因素、多阶段的动态顺序演变过程,涉及多种癌基因的激活、抑癌基因的失活及由此引起的细胞生物学行为的改变。一氧化氮(nitric oxide,NO)是人体内的一种具有生物活性的分子。内源性NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化左旋-精氨酸(L-Arg)与氧分子经多步氧化还原反应产生的[1]。机体对 NO的调节主要是通过对3种不同的NOS来实现的,即内皮型NOS(eNOS)、神经型NOS(nNOS)和诱导型NOS (iNOS),而iNOS诱导产生的大量NO为其产生病理作用的基础[2]。近年来有研究[3-4]显示,在炎症组织及多种肿瘤组织中均可检测到表达上调的 iNOS,但iNOS在胃癌组织中表达情况的研究结果却报道不一。作者选取不同病理阶段的胃黏膜新鲜组织标本,采用原位分子杂交方法对iNOSmRNA表达情况进行检测,从分子水平探讨iNOS与胃癌发生发展的关系及意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择郑州大学第一附属医院2006年 3月至 2007年 12月外科手术切除胃癌组织标本65例,病理证实为腺癌,其中男 41例,女 24例;年龄(53.5±11.2)岁;肿瘤直径:＜5 cm 31例,≥5 cm 34例;肿瘤部位:胃贲门部 20例,胃体部 28例,胃窦部17例;组织学分型:高、中分化37例,低分化28例;浸润深度:未侵及浆膜层 25例,侵及浆膜层及以外 40例;淋巴结转移情况:无转移 24例,有转移 41例;术前均未行放疗和化疗。另自胃镜下取35例慢性浅表性胃炎、24例慢性萎缩性胃炎伴肠化生及 21例不典型增生胃黏膜组织标本。慢性浅表性胃炎患者中男20例,女15例,年龄(38.2±10.7)岁;慢性萎缩性胃炎伴肠化生患者中男 13例,女 11例,年龄(50.4±5.6)岁;不典型增生患者中男11例,女 10例,年龄(52.5±6.7)岁。所取新鲜标本均经 40 g/L多聚甲醛液固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、4μm厚连续切片备用。以上标本均经HE染色及 2位病理学专家确认。

1.2 不同胃黏膜病变组织中iNOSmRNA检测方法 采用原位分子杂交法,原位分子杂交检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。组织切片常规脱蜡至水化;滴加体积分数3%过氧化氢室温15min,滴加体积分数3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶,37℃30min以暴露mRNA片段;滴加预杂交液,37℃4 h;滴加杂交液,覆盖蜡膜40～42℃恒温箱过夜;梯度 SSC洗涤,滴加封闭剂,37℃30 min;滴加生物素化兔抗地高辛,37℃60min;滴加ABC,室温20 min;DAB显色;苏木素复染、分化、脱水透明、封片。用不含探针的预杂交液代替杂交液作阴性对照,以已知肺癌阳性染色切片作为阳性对照。

1.3 结果判定[5]iNOSmRNA以细胞胞质着棕黄色为阳性。染色结果综合染色强度及阳性细胞数行半定量分析。在排除非特异性染色及边缘效应的前提下,400倍光镜下观察并判定。每例观察 5个视野,每个视野计数 100个细胞。阳性细胞数判定:＜10%0分,10%～1分,25%～2分,50%～3分;染色强度判定:无着色 0分,染色弱 1分,染色清晰 2分,染色强 3分。结果取 2项评分之和:0～1分,阴性;≥2分,阳性。

1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0进行分析,不同胃黏膜病变组织中iNOSmRNA阳性表达率的比较采用χ2检验,不同病理特征胃癌组织中iNOSmRNA阳性表达率的比较采用 χ2检验,检验水准 α= 0.05。

2 结果

2.1 不同胃黏膜病变组织中iNOSm RNA的检测结果 iNOSmRNA主要表达于胃癌细胞,巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞中亦有部分表达。在慢性浅表性胃炎胃黏膜腺体细胞中呈淡棕黄色,在慢性萎缩性胃炎伴肠化生和不典型增生胃黏膜腺体细胞中有中亦有表达。见图 1和表 1。

2.2 iNOSmRNA表达与胃癌病理特征的关系65例胃癌组织中,iNOSmRNA的阳性表达与组织学分型、浸润深度及有无淋巴结转移有关,而与其肿瘤大小及部位无关。见表 2。

图1 不同胃黏膜病变组织中iNOSmRNA染色结果(原位分子杂交法,×400)

表1 不同胃黏膜病变组织中iNOSmRNA的表达情况

表2 iNOSmRNA表达与胃癌病理特征之间的关系

3 讨论

20世纪 80年代,NO才被认识到是人体内的一种具有生物活性的分子。人体内的 NO有 2种来源,一种为非酶生型即来自于体表或摄入的无机氮的化学降解和转化,一种为酶生型即由NOS催化合成。内源性 NO既有细胞保护功能又具有细胞毒性的双重作用,其作用方向取决于生成的 NO的量。而iNOS诱导产生的大量NO为其产生病理作用的基础[2]。现已证实[3-4]iNOS广泛存在于人和哺乳类动物的多种细胞中,包括多种肿瘤细胞及癌前病变组织细胞中,如肝癌、胰腺癌、大肠癌、食管癌和 Barrett's食管等。国外研究[6]发现,在炎症初期,NO主要起抗炎作用,随炎症的持续发展,大量的 NO释放入组织并发挥组织损伤作用。同时,炎症病灶区存在许多激活的炎性细胞,炎性细胞可被诱导产生iNOS,随iNOS活性增强将释放大量NO和超氧化物,NO促进内源性亚硝胺形成,内源性亚硝胺成为感染和炎症组织发生肿瘤的危险因素。还有研究[7]发现,幽门螺旋杆菌感染可使胃黏膜 iNOS含量增加,而iNOS诱导产生的大量NO及其供体在转录水平即可促进炎症损伤及诱发肿瘤形成。长期慢性炎症刺激已成为某些肿瘤发生的危险因素之一。该研究结果显示,iNOSmRNA阳性染色主要位于胃癌细胞胞质中,巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞中亦有部分表达。在慢性浅表性胃炎胃黏膜腺体细胞中呈淡棕黄色弱表达。在慢性萎缩性胃炎伴肠化生、不典型增生胃黏膜腺体细胞中有中、高强度表达。提示,iNOS在促胃癌发生发展过程中遵循肠型胃癌发生模式:浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生→不典型增生→胃癌的顺序演变过程,即iNOS参与了胃癌形成的全过程,并可能为其早期事件。而长期慢性炎症刺激又可能成为某些肿瘤发生的更早期危险因素之一。所以,早期阻断危险因素或消除其产物将为临床治疗提供有效途径及可靠理论依据。

研究[8]表明,iNOS可通过激活癌基因/抑制抑癌基因、抗凋亡/促增殖、促肿瘤血管生成、促肿瘤细胞侵袭转移和抑制宿主免疫等多种途径参与胃癌的形成,iNOS蛋白的高表达与胃腺癌的肿瘤大小、浸润深度、TNM分期、有无淋巴结转移及随访存活率有关。另有研究[9]表明,NO不仅可限制 T细胞的增生,且可提高前列腺素合成酶的活性而抑制NO介导的巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的作用,从而削弱宿主抗肿瘤作用。该研究结果显示,iNOSmRNA的表达与胃癌组织学分型、浸润深度及有无淋巴结转移均有关,提示iNOS可能作为胃癌形成晚期的一个重要促侵袭转移因子而加速肿瘤发展演进。但也有相反的研究结果,如Cha等[10]则认为 NO是内源性的血管生成抑制剂。这 2种相反的结果可能是由于局部NO浓度不同所致,还有待于进一步深入研究。

有研究[11]表明,联合抑制 NO的非甾体抗炎药较传统的抗炎药更具抗癌作用。提示,从分子水平研制更具选择性的iNOS抑制剂或联合性抑制剂,将为今后的临床肿瘤防治工作提供有效途径和美好前景。

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