三聚氰酸和三聚氰胺对肉鸡生长性能的影响及其组织残留的研究

王 亮 丁雪梅 张克英 白世平 吴彩梅

(四川农业大学动物营养研究所,教育部抗病营养重点实验室,雅安 625014)

三聚氰酸(cyanuric acid,CYA)和三聚氰胺(melam ine,MEL)是 2种有机合成原料,均不得用作食品和单胃动物饲料添加剂。但是饲料原料生产过程中使用的肥料(如双缩脲)、药物(环丙氨嗪)可在动植物体内代谢产生 MEL及其同系物,而 MEL也可能通过环境、包装材料进入食品或饲料中[1-2];另外,CYA和 MEL氮含量较高[3],可提高凯氏定氮法测定的饲料中粗蛋白质的含量,不法分子乘机牟取暴利。调查研究表明,MEL和CYA联合毒性是美国“宠物中毒”事件和中国“三鹿奶粉”事件的元凶[4]。2008年 10月,香港发生的鸡蛋中检出 MEL事件,将 MEL及其同系物污染事件的影响蔓延至畜产品生产及加工行业,引起人们对畜产品安全问题的加倍关注。同年,中国农业部开展了畜禽及宠物饲粮中 MEL限量专项研究。本课题组研究了肉鸡饲粮中添加高(250～2 000mg/kg)[5]、低(2～100mg/kg)[6]剂量 MEL及CYA(3.3～33.3mg/kg)与 MEL(10～100mg/kg)按一定比例(1∶3)联合添加对肉鸡生长性能和健康的影响。但目前的研究多是单独添加 MEL对畜禽生长及健康的影响,有关其同系物 CYA以及二者联合添加的相关研究并不多见。本试验在前人研究基础上进一步研究饲粮不同 CYA水平及与 MEL联合添加对肉鸡生长性能的影响及其在肉鸡体内的残留,为全面评估 CYA及与 MEL的联合毒性提供参考依据,为食品安全风险评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

MEL,分析纯,含量≥99.5%,购自北京化学试剂公司;CYA,化学纯,含量≥98%,购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验设计及饲粮

本试验采用 2×5两因子随机区组试验设计,CYA设 5个水平：0、10、20、33.3和 50 mg/kg,MEL设 2个水平：0和 100 mg/kg。共 10个处理,每个处理 6个重复,每个重复 20只鸡。

基础饲粮为玉米 -豆粕型饲粮,参考 NRC(1994)肉鸡饲养标准并结合中国饲养标准(NY/T 33—2004)配制,分为 1～21和 22～42 d 2个阶段,所有饲粮均为粉料。所用玉米、豆粕、DL-蛋氨酸以及配合饲料经分析均未检出 CYA和 MEL。各阶段基础饲粮组成及营养水平见表 1。

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets(air-dry basis) %

1.3 试验动物与饲养管理

试验选用 1 200只 1日龄健康肉鸡公雏,品种为科宝 500,在四川农业大学动物营养研究所试验场进行。肉鸡采用网上平养,1日龄雏鸡按初始体重无差异原则随机分入各个处理,红外灯保温。采用连续光照,自由采食和饮水。参照常规免疫程序进行免疫接种。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能

分别于试验的第 1、22和 43天以重复为单位称重,称重前 12 h断料。计算各阶段体重、体增重、平均日采食量和料重比。

1.4.2 养分表观利用率

生长试验结束后,各重复选 1只健康、接近平均体重的试鸡单笼饲养,自由采食和饮水,采用全收粪法进行代谢试验。预饲2 d,收集所有排泄物 4 d,剔除毛屑杂物,-20℃保存。试验结束混匀 4 d内收集的排泄物,65℃烘干,充分回潮,粉碎后测定饲粮及粪中粗蛋白质、总能、钙和磷含量,计算养分表观利用率。计算公式如下：

养分表观利用率(%)=[1-(粪中养分含量 ×风干粪样重量)/(饲粮养分含量 ×采食量)]×100。

1.4.3 血浆、组织中 CYA及 MEL的残留

样品采集：分别于试验第 22和 43天,每个重复挑选1只健康、接近平均体重的试鸡,翅下采血5m L,注入含有肝素钠的无菌离心管中,3 000 r/min离心10min,分离血浆。放血屠宰后分离肝脏和肾脏,统一取右侧胸肌(50 g左右),-20℃保存,采用LC-MS/MS法测定 CYA和 MEL残留。

测定方法：参考 Qiu等[7]动物组织中 CYA和MEL含量的测定方法。

1.5 数据分析

采用 SPSS 13.0的 GLM程序对数据进行两因子方差分析,每个重复为 1个试验单元,处理效应包括 CYA和 MEL水平以及二者的互作效应;血浆、组织中的 CYA和 MEL残留采用单因素方差分析。以 P＜0.05作为各项数据差异的显著性水平,采用Duncan氏法比较各处理平均值间差异显著性。所有结果采用“平均值 ±标准差”形式表示。

2 结 果

2.1 CYA和/或 M EL对肉鸡生长性能的影响

饲粮添加 CYA和/或 MEL对肉鸡生长性能的影响见表 2。饲粮中添加 10～50mg/kg CYA对肉鸡 21 d体重、1～21 d体增重和平均日采食量有不利影响;CYA与 100 mg/kg MEL联合添加对肉鸡的生长性能无显著交互作用(P＞0.05)。

2.2 CYA和/或 MEL对肉鸡养分表观利用率的影响

CYA和/或 MEL对肉鸡养分表观利用率的影响见表 3。CYA对肉鸡饲粮粗蛋白质、磷、钙表观利用率无显著影响(P＞0.05),50mg/kg CYA的处理总能表观利用率与对照组差异显著(P＜0.05),CYA与 100mg/kg MEL联合添加对肉鸡养分表观利用率无显著交互作用(P＞0.05)。

2.3 CYA和 MEL在肉鸡血浆、组织中的残留

表 4、表 5显示,对照组各组织中均未检出CYA;其余各处理在肌肉和肝脏中未检出 CYA,但在血浆和肾脏中检出 CYA,其中肾脏中残留量最高。各处理血浆 CYA残留量无显著差异(P＞0.05),肾脏 CYA残留量以 CYA单独添加 33.3和50mg/kg的处理最高,并且显著高于单独添加 10和 20 mg/kg的处理(P＜0.05);CYA与 MEL联合添加未进一步增加组织中 CYA残留量。

未添加 MEL的处理血浆中均未检出 MEL,但在肌肉、肝脏、肾脏组织中均检出微量 MEL;添加MEL的各处理在肌肉、肝脏和肾脏均检出 MEL,且肌肉和肾脏中残留量极显著高于未添加 M EL的处理(P＜0.01);CYA与 MEL联合添加的处理肝脏和肾脏中 MEL残留量显著高于单独添加MEL的处理(P＜0.05)。

3 讨 论

3.1 CYA和/或 MEL对肉鸡生长性能的影响

美国食品药品管理局(FDA)调查研究指出,CYA和 MEL均属低毒性物质,只有长期大量服用或注射才会损害生殖、泌尿系统,进而引起食欲不振、精神萎靡、死亡率上升等症状[8-9]。Gao等[10]研究表明,饲粮中添加 2～100mg/kg MEL并未导致蛋鸭精神萎靡、死亡率上升等,但有降低产蛋性能的趋势。丁雪梅等[6]、Lv等[11]研究表明,单独添加 2～100 mg/kg MEL对肉鸡生产性能并无显著不利影响。本试验单独添加 0～50 mg/kg CYA或与 100mg/kg MEL联合添加,未发现肉鸡出现精神萎靡、食欲不振、死亡率高等不良反应,与前人的研究结果一致。但添加 10～50 mg/kg CYA或100 mg/kg MEL会降低 21 d体重和 1～21 d体增重,具有一定的 CYA剂量效应;但在 22～42 d无相应趋势,表明 CYA及 MEL对幼龄肉鸡生长可能有一定的不利影响。CYA与 MEL联合添加未进一步降低肉鸡生长性能,其原因可能是本试验中 CYA和 MEL的添加剂量相对于前人研究(250 mg/kg)[5,8]较低。

表 2 CYA和/或M EL对肉鸡生长性能的影响Table 2 Effects of CYA and/or MEL on grow th performance of broilers

表 3 CYA和/或M EL对肉鸡养分表观利用率的影响Table 3 Effects of CYA and/or MEL on apparent nutrientavailability of broilers

表 4 CYA在肉鸡血浆、组织中的残留Table 4 CYA residues in p lasma and tissues of broilers

表 5 MEL在肉鸡血浆、组织中的残留Table 5 MEL residues in p lasma and tissues of broilers

CYA和 MEL对畜禽养分利用率的影响尚未见报道。世界卫生组织(WHO)及 FDA的调查报告中指出,CYA和 MEL的联合毒性是系列中毒事件的源头[4],但有关二者联合比例的研究尚不多见。Xu等[12]研究中指出,CYA和 MEL不只存在 1∶1的结合方式,还存在 1∶3的结合方式,说明 CYA和MEL的结合方式并不单一,但是否影响毒性还需进一步研究。本试验中,单独添加低剂量的 CYA以及 CYA与 MEL联合添加对粗蛋白质、总钙和总磷的表观利用率均没有显著影响。但与对照组相比,50mg/kg CYA显著降低总能的利用率(P＜0.05),33.3mg/kg CYA单独或与100mg/kg MEL联合添加对总能利用率也有不利影响;但 10～20 mg/kg CYA与 100mg/kg MEL联合添加并未影响总能利用率。

3.2 CYA和 MEL在组织中的残留

CYA和 MEL在食品中的蓄积已经成为当前国际食品安全领域重点关注的问题之一。2008年“三鹿奶粉”事件之后,中国卫生部等 5部门公布奶粉及乳制品中 MEL限量值为 2.5mg/kg,并明令禁止人为添加,该限量也得到了 WHO的认可。2009年6月,农业部颁布的《中华人民共和国农业部公告第1218号》规定,MEL是工业原料,禁止人为添加,但可能通过环境、包装材料等混入,为保证养殖动物及其产品安全,饲料原料和饲料产品中 MEL的限量值为 2.5mg/kg。但其他食品中 MEL以及 CYA的限量值尚未有规定。有研究报道,饲粮中的 CYA和 MEL会在动物组织中残留,以肾脏中为最高[13-14]。但关于二者联合添加对残留量影响的研究结果并不一致。Lv等[15]比较了饲喂添加 MEL和/或 CYA饲粮的羔羊组织中 MEL和 CYA的残留量,研究表明,羔羊组织中 MEL的残留量与是否添加 CYA无关。但 Reimshuessel等[16]分别以鱼、猪、猫等作为研究对象得出,MEL和 CYA联合添加会影响二者在鱼组织中的残留量。造成该差异的原因可能与动物的种属差异有关。另外,Seffernick等[17]报道,MEL在微生物作用下会发生一系列的变化而形成其同系物(如 CYA)或者结构相近的物质,而这种反应很有可能在胃肠道或者其他部位的微生物群落的作用下发生。本试验表明,饲粮中添加10～50mg/kg CYA可在肉鸡血浆和肾脏中检测到残留,随添加剂量增加,肾脏中残留量也增加;单独添加 MEL 100 mg/kg也会有 CYA残留,可能是MEL在胃肠道微生物的作用下发生转化,生成了CYA;MEL并不影响 CYA的残留量,其机理有待进一步研究。未添加 MEL处理的肉鸡血浆中并无MEL残留,可能是 MEL含量低且在血浆中半衰期较短,采样前 12 h断料后已代谢出血浆;未添加MEL的处理肉鸡组织中均检出微量 MEL,其来源尚不清楚,可能是饲料原料中的环丙氨嗪在肉鸡体内的代谢产物或者是添加 CYA的处理在胃肠道微生物的作用下发生了转化。添加 MEL 100 mg/kg可显著增加其在肉鸡组织中的残留;CYA与MEL联合添加未进一步增加组织中 CYA残留量,但可极显著增加 MEL在肌肉、肾脏组织的残留;与单独添加 MEL相比,联合添加还显著增加了肝脏和肾脏中 MEL的残留。此外,CYA与 MEL的比例影响MEL在组织中的残留量,肾脏 M EL残留量以 CYA与 MEL比例为 1∶3时最高,而肝脏中 MEL残留量以 CYA与 MEL比例为 1∶5时最高,可能与二者比例影响其在体内的代谢和排泄方式有关,因而对肝脏和肾脏的损伤不同。但为何 CYA与 MEL联合添加会增加组织中 MEL残留量的机理有待进一步研究。

4 结 论

①本试验条件下,饲粮中添加 10～50 mg/kg CYA对幼龄肉鸡生长性能有不利影响,50 mg/kg CYA显著降低总能表观利用率。

② 10～50 mg/kg CYA、100mg/kg MEL及二者联合添加均会导致肉鸡组织中 CYA和 MEL残留,二者联合添加增加 MEL在肉鸡组织中的残留量,其比例影响 MEL的残留量。

[1] REIMSHUESSEL R,HATTAN D G,GU Y.Background paper on toxico logy o f melam ine and its analogues[R].Ottawa：WHO＆FAO,2008.

[2] LIM LO,SCHERER S J,SHULER K D,etal.D isposition of cyromazine in plants under environmental conditions[J].Journal o f Agricultural and Food Chem istry,1990,38：860-864.

[3] 胡虎,盛宏强,马晓琼,等.三聚氰胺及其同系物三聚氰酸的生物学效应和毒理学研究进展[J].浙江大学学报：医学版,2008,37(6)：544-550.

[4] BROWN C A,JEONG K S,POPPENGA R H,et al.Outbreaks of renal failure associated w ithmelam ine and cyanuric acid in dogs and cats in 2004 and 2007[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,2007,19：525-531.

[5] 李倜,丁雪梅,张克英,等.饲粮中添加三聚氰胺对肉鸡生长性能和健康的影响[J].动物营养学报,2010,22(6)：694-1702.

[6] 丁雪梅,张克英,王亮.三聚氰胺对肉鸡毒性作用分析[J].动物营养学报,2011,23(1)：122-129.

[7] QIU J,ZHANG Y,YU H X,et al.An optim ized method for simu ltaneous determ ination of melam ine and cyanuric acid in animal tissues by liquid chromatography-trip le quadrupolemass spectrometry[J].Der Pharma Chem ica,2009,1(2)：269-277.

[8] PUSCHNER B,POPPENGA R H,LOWENSTINE L J,et al.Assessment o f melam ine and cyanuric acid toxicity in cats[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,2007,19：616-624.

[9] DOBSON R L M,MOTLAGH S,QUIJANO M,et al.Identification and characterization of toxicity of contam inants in pet food leading to an outbreak of renal toxicity in cats and dogs[J].Toxicilogical Sciences,2008,106(1)：251-262.

[10] GAO CQ,WU SG,YUE H Y,etal.Toxicity of dietary melam ine to laying ducks：biochemical and histopatho logical changes and residue in eggs[J].Journal of Agriculturaland Food Chem istry,2010,58,5199-5205.

[11] LV M B,YAN L,GUO JY,et al.Melam ine residues in tissues of broilers fed diets containing graded levels of melam ine[J].Poultry Science,2009,88：2167-2170.

[12] XUW,DONG M D,GERSEN H,et al.Cyanuric acid and melam ineon Au(111)：structure and energetics of hydrogen-bonded netw orks[J].Small,2007(3)：854-858.

[13] BAI X,BAIF,ZHANG K Y,etal.Tissue deposition and residue dep letion in laying hens exposed to melam ine-contam inated diets[J].Journal o f Agricu ltural and Food Chem istry,2010,58：5414-5420.

[14] 武书庚,高春起,岳洪源,等.三聚氰胺在鸭蛋中的沉积和消除规律的研究[J].动物营养学报,2010,22(2)：416-423.

[15] LV X W,WANG J,WU L,et al.Tissue deposition and residue depletion in lambs exposed to melam ine and cyanuric acid-vontam inated diets[J].Journal of Agricu ltural and Food Chem istry.2010,58：943-948.

[16] REIMSHUESSEL R,G IESEKER C M,M ILLER R A,et al.Evaluation of the renal effects o f experimental feeding of melam ine and cyanuric acid to fish and pigs[J].American Journal o f Veterinary Research.2008,69：1217-1228.

[17] SEFFERNICK JL,SOUZA M L,SADOWSKY M J,et al.Melam ine deam inase and atrazine ch lorohyd rolase：98 percent identical but functionally different[J].Journal o f Bacteriology,2001,183(8)：2405-2410.