百合抗尖孢镰刀菌无性系的离体筛选

丁丁，吕长平，王继华，崔光芬，吴学尉，张艺萍*

（1.云南省农业科学院 花卉研究所，云南 昆明 650205；2.云南省花卉育种重点实验室，云南 昆明 650205；3.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128）

百合是世界上重要的商品花卉之一，近年来的生产和消费呈逐年上升趋势。据统计，目前全球百合种球的贸易额达20多亿美元[1]。病虫害问题一直是制约切花百合质量提高的首要因素。由尖孢镰刀菌百合专化型（Fusarium oxysporumf. sp.lilii）土传真菌引起的枯萎病是百合最严重的土传病害之一[2]，在全世界百合种植区均有感染和为害。为有效控制百合枯萎病，多年来，国内外科研工作者对这种病害的病原生物学、病害流行学、防治方法等进行了研究，摸清了百合枯萎病菌的习性和枯萎病的发生规律，认为选育和合理利用抗病品种是有效防治该病的手段之一[3-5]。常规杂交选育百合新品种是一个漫长的过程，通常需要10年以上的时间，而采用体细胞无性系变异离体筛选技术，可加速抗性育种进程。利用病原菌毒素或类似物质作为选择剂，已筛选出抗甜菜褐斑病[6]、抗油菜黑胫病[7]、抗烟草野火病[8]、抗水稻纹枯病[9]、抗玉米小斑病[10]、抗小麦赤霉病[11]、抗茄子黄萎病[12]、抗番茄晚疫病[13]、抗西瓜枯萎病[14]和抗香蕉枯萎病[15]等突变体，但还没有关于百合等花卉的尝试。笔者以百合为试验材料，附加不同浓度的镰刀菌毒素粗提液进行抗性突变体的筛选，以期获得百合抗镰刀菌的育种中间材料。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试材料为元帅（Acapulco）、卡萨布兰卡（Casablanca）2个百合商业品种的愈伤组织。所用尖孢镰刀菌百合转化型（Fusarium oxysporumf. sp.lilii） lily-F菌株由农业部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明）提供。

主要仪器为日立S-3000N型扫描电镜和美国贝克曼库尔特公司的DU640型紫外分光光度计。

1.2 方 法

1.2.1 尖孢镰刀菌粗毒素的制备

将马铃薯蔗糖培养基上的尖孢镰刀菌落切成约5 mm×5 mm 的方块，接种于装有150 mL 马铃薯蔗糖培养液的三角瓶中，每瓶3块，置于控温摇床上，振荡培养15 d。摇床转速120 r/min，温度25 ℃。待菌丝体长出，且营养液由混浊变为澄清时，用双层纱布过滤掉菌丝和孢子，滤液300 r/min离心20 min后，去沉淀，上清液煮沸15 min，冷却后，用细菌过滤器过滤灭菌，即得到无菌毒素粗提液[16]。

1.2.2 尖孢镰刀菌毒素活力的测定

1） 用幼苗浸渍法测定：取Acapulco的愈伤组织再生组培苗，洗净根部培养基，分别用体积分数100%、80%、60%、40%、20%的毒素粗提液浸泡根部，放25 ℃光照培养箱，逐日观察幼苗失水萎蔫情况。以无菌水浸泡为对照。病情分级标准：0级为健康无病；1级为1～2片叶片叶缘卷曲萎蔫；2级为3～4片叶片卷曲萎蔫；3级为5～6片叶片卷曲萎蔫；4级为叶片几乎全部萎蔫，甚至死亡。

2） 用愈伤组织浸渍法测定：用毒素粗提液原液浸泡Casablanca的愈伤组织，分别在浸泡后24、48 h取样，在扫描电镜上观察、拍照。以未用毒素原液处理的愈伤组织为对照。

1.2.3 抗病突变体的筛选

1） 筛选压的确定。分别配制体积分数20%、40%、60%、75%的毒素粗提液。愈伤组织继代培养基（经前期试验确定）为MS+2 mg/L Picloram + 0.03 mg/L TDZ +500 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L酵母提取物。以不添加毒素的愈伤继代培养基为对照。分别将Acapulco、Casablanca的愈伤组织接种到上述培养基上，培养10 d，观察、统计愈伤组织的存活率。以存活率为10%～30%的毒素浓度为临界致死浓度[17]。

2） 毒素粗提液的加压筛选。采用一步选择法，将上述试验中确定为临界致死浓度的毒素粗提液附加到愈伤继代培养基中，此培养基即为抗病筛选的选择培养基。将Acapulco、Casablanca的愈伤组织接种于选择培养基上，10 d后将存活的愈伤组织转入未添加毒素的愈伤组织继代培养基上培养10 d，再转入选择培养基进行筛选，如此反复筛选3次。将最终存活的愈伤组织转入再生培养基（经前期试验确定）MS+1.0 mg/L BA +0.1 mg/L KT +0.1 mg/L IBA中诱导分化，30 d后统计分化率。

1.2.4 抗尖孢镰刀菌无性系再生苗防御酶活性测定和抗病性鉴定

对Acapulco、Casablanca抗病愈伤组织再生苗人工接种百合枯萎病菌孢子悬浮液（孢子5×105个/mL），每处理5株，重复3次，每重复2株。以未经筛选的再生百合组培苗为对照。分别在接种后0、12、24、36、48 h取样，在紫外分光光度计上测定过氧化物酶（POD）[18]、超氧化物歧化酶（SOD）[19]、多酚氧化酶（PPO）[20]的活性。7 d后观察筛选株的感病情况。病情分级与1.2.2分级标准相同。病情指数=Σ（（病级植株数×病级代表数值）/（总植株数×最高病级代表数值））×100[21]。按样本的病情指数划分抗性等级：高抗≤20，中抗＞20～50，中感＞50～80，高感＞80。

医院急危重症患者较多，急救队伍面临的压力也相对较大。急救时间和措施也关系着患者被救治成功率及愈后生活质量。医院对于急诊科，从人员配备、设备配置、技术人员培养、职工绩效等方面，都给予了政策上一定程度的倾斜。

1.2.5 数据处理

用Excel 2000和SPSS 13.0分析处理数据。

2 结果与分析

2.1 尖孢镰刀菌毒素粗提液的活性和筛选压

2.1.1 尖孢镰刀菌毒素粗提液的活性

百合幼苗经尖孢镰刀菌毒素粗提液处理后，叶片逐渐萎蔫致死。从表1可以看出，毒素体积分数100%时，2 d后幼苗开始萎蔫，5 d后死亡；毒素体积分数40%时，3 d后幼苗叶片轻度萎蔫。可见毒素浓度越高，幼苗萎蔫越快，程度越重；毒素体积分数20%时，4 d幼苗叶片只有轻度萎蔫。

经毒素处理的Casablanca愈伤组织细胞的电镜扫描结果（图1）表明，镰刀菌毒素对愈伤组织细胞产生毒害，且随着处理时间的延长，毒害加重：未经毒素处理的愈伤组织细胞排列紧密，细胞内含物丰富；处理24 h后，愈伤组织细胞出现破裂和塌陷现象；处理48 h后，愈伤组织细胞所受毒害加重，出现蜂窝状大面积塌陷，细胞解体。

表1 不同体积分数尖孢镰刀菌粗毒素对百合再生苗的影响Table 1 Effects of Fusarium toxin concentration on plantlet regeneration of lily

图1 卡萨布兰卡愈伤组织细胞的电镜扫描结果Fig.1 Scanning electron micrographs on callus of Casablanca

“－” 无反应，植株正常；“+” 轻度反应，1～2片叶片叶缘卷曲萎蔫；“++”中度反应，大部分叶片卷曲萎蔫；“+++”重度反应，全部叶片卷曲萎蔫；“++++”全部死亡。

幼苗浸渍法和愈伤组织浸渍法对镰刀菌毒素活力的测定结果表明，无论在细胞水平，还是在植株水平，镰刀菌毒素都对百合产生毒害，且随处理时间的延长，毒害加重，说明在发酵培养过程中镰刀菌毒素已充分释放到培养原液中，用此原液作为选择剂，对抗镰刀菌无性系进行筛选是可行的。

由表2可看出，毒素对2个品种愈伤组织的生长均表现抑制作用。随着毒素体积分数的增大，愈伤组织存活率降低，抑制效果愈明显。75%毒素粗提液下，2个品种愈伤组织的存活率分别为20%和25%.

表2 不同体积分数尖孢镰刀菌粗毒素对百合愈伤组织生长的影响Table 2 Effects of different concentrations of Fusarium toxin on lily callus

从愈伤组织表现状态上看，10 d时，75%毒素粗提液处理的愈伤组织松散，褐化死亡，只有极少数存活，因此，75%毒素体积分数处理10 d可视为大部分细胞生长的1个拐点，在抗尖孢镰刀菌无性系筛选试验中，75%毒素体积分数就是临界致死浓度，可使用含此浓度毒素的培养基作为选择培养基。

2.2 抗尖孢镰刀菌无性系的获得

经体积分数75%的尖孢镰刀菌粗毒素筛选后，240块Acapulco愈伤组织有28块存活，存活率为11.67%，其中又有 10块分化出了不定芽，分化率为35.71%，突变率为4.17%；240块Casablanca愈伤组织有47块存活，存活率为19.58%，其中有14块分化出了不定芽，分化率为 29.79%，突变率为5.83%。Casablanca的存活率和分化率都比Acapulco高。以上结果表明，经体积分数75%的毒素处理过的细胞已经发生突变，并且部分抗镰刀菌毒素的突变基因得到表达，从而使愈伤组织能在镰刀菌毒素的临界致死浓度下生存下来。

2.3 抗尖孢镰刀菌无性系人工接种的抗病性

与对照株相比，Acapulco和Casablanca抗尖孢镰刀菌无性系人工接种镰刀菌孢子悬浮液后7 d，其植株正常生长，对枯萎病表现出一定的抗性。抗性鉴定结果（表4）表明，Acapulco和Casablanca的抗病突变株均达到中抗水平。

表3 抗尖孢镰刀菌无性系人工接种对枯萎病的抗性Table 3 The evaluation of lily plantlets regenerated for resistance to Fusarium wilt

2.4 抗尖孢镰刀菌无性系人工接种后的防御酶活性

从图2和图3可以看出，经孢子悬浮液接种后，2品种抗尖孢镰刀菌无性系的POD、PPO活性均呈先升高后降低的变化趋势。2品种抗尖孢镰刀菌无性系的 POD、PPO活性比其对照株均有所提高，Acapulco抗尖孢镰刀菌无性系的POD变化明显，峰值比对照株提高了106.54 U/（g·min）；其PPO活性比对照株也有明显增长。Casablanca抗尖孢镰刀菌无性系的POD活性变化幅度比Acapulco抗尖孢镰刀菌无性系小，但峰值比对照株也提高了 20.13 U/（g·min）；在整个测试过程中，抗尖孢镰刀菌无性系PPO活性的变化明显，但其对照的变化不大。

图2 人工接种枯萎病菌后不同时间再生百合苗叶片的POD活性Fig.2 POD activity of leaves of lily regeneration plants at different time after inoculation of Fusarium

图3 人工接种枯萎病菌后不同时间再生百合苗叶片的PPO活性Fig.3 PPO activity of leaves of lily regeneration plants at different time after inoculation of Fusarium

从图4可以看出，接种孢子悬浮液后，2品种抗尖孢镰刀菌无性系的SOD活性升高，但Casablanca对照株的SOD活性在36 h后下降。2品种抗尖孢镰刀菌无性系SOD活性比其对照株均有提高。SOD活性随着处理时间的延长而增加，说明经孢子悬浮液处理后百合植株清除氧自由基的能力增强。

图4 人工接种枯萎病菌后不同时间再生百合苗叶片的SOD活性Fig.4 SOD activity of leaves of lily regeneration plants different time after inoculation Fusarium

3 结论与讨论

a. 采用一步选择法，将百合愈伤组织接种在含临界致死浓度镰刀菌毒素粗提液的培养基上，反复筛选最终得到了抗尖孢镰刀菌无性系植株。利用真菌毒素作为选择剂，必须注意适宜的筛选浓度和筛选周期，同时在起始筛选时，必须有较大的供选群体。采用适宜毒素浓度是抗病筛选的关键，浓度过高，不易得到数量较多的愈伤组织或细胞；浓度过低，不易筛选出抗性材料。

b.用镰刀菌孢子悬浮液接种百合抗尖孢镰刀菌无性系植株之后，Acapulco和Casablanca的对照株与抗尖孢镰刀菌无性系植株叶片内的SOD、POD、PPO活性均先升高后降低，但抗尖孢镰刀菌无性系植株的变化更为明显，酶活性保持较高水平，可见，SOD、POD、PPO活性可以作为初步鉴定抗性突变体的指标。

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英文编辑：罗文翠