杜仲总黄酮的提取工艺优化

(湖南省张家界市药品检验所，湖南 张家界 427000)

杜仲为杜仲科杜仲属植物，俗称木棉、丝连皮等，原产于我国，在日本、朝鲜、缅甸亦有栽培。现代药理研究表明，杜仲含有绿原酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、黄酮类物质、地普黄内酯、多糖等活性成分，具有补肝肾、坚筋骨、降压、抗菌、利尿、抗肿瘤、久服轻身耐老之功效。由于杜仲独特的药用价值和潜在的经济价值，国内外学者对其化学成分和生物活性作了大量的研究[1]。黄酮类化合物具有降血糖、调血脂、抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、消除体内自由基等药理作用[2]，因此经济、高效的黄酮提取工艺极其重要。微波是一种超高速电磁波，具有很强的穿透作用，能使植物细胞中的水分或有机溶剂迅速升温升压，使细胞壁穿孔，让有效成分从细胞中溶出，而且微波电磁场能使分子运动短时间内加剧，从而缩短了提取时间，提高了提取率[3]。本试验通过比较回流提取法、超声提取法、微波提取法对黄酮提取率的影响，采用正交试验法优选黄酮的最佳提取工艺。现报道如下。

1 仪器与材料

TU－1901型紫外分光光度计(北京惠普通用仪器公司);AUW220D型电子分析天平(日本岛津公司);格兰仕WD800G型微波炉(佛山市顺德微波炉电器有限公司);KQ2200型超声波清洗机(昆山超声仪器公司);HHS－2S型电热恒温水浴锅(上海南阳仪器有限公司);QE－500型摇摆式高速万能粉碎机(浙江省武义县屹立工具有限公司)。杜仲(市售品);芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定方法(紫外分光光度法)

2.1.1 方法学考察

标准曲线绘制:精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，用75%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，混匀。精密吸取此液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，各加 5% 亚硝酸钠 0.3 mL，放置 6 min，再加硝酸铝 0.3 mL，放置 6 min，加 4% 氢氧化钠溶液2 mL，以75%乙醇稀释至刻度，摇匀。在510 nm波长处，以空白试剂为参比测定吸光度，回归方程为 A=11.70 C－0.004 4，r2=0.999 4(n=6)。结果表明，芦丁对照品质量浓度在0.005～0.025 g/L范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验:取对照品溶液(0.010 2 g/L)，依法连续测定5次。结果的 RSD为0.35%(n=5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:精密称取同一样品10 g，共5份，依法测定含量。结果的 RSD为0.31%(n=5)，表明方法重复性较好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于配制后0，15，30，45，60 min时依法测定。结果吸光度的 RSD为0.88%(n=5)，表明供试品溶液在60 min内稳定。

加样回收试验:精密取芦丁对照品溶液(0.102 18 g/L)1.0 mL，加入到杜仲提取液中做回收试验，重复3次。结果见表1。

表1 芦丁加样回收试验结果(n=3)

2.1.2 样品含量测定

取一定量样品的提取液，按标准曲线绘制项下方法处理，分别用分光光度计在510 nm波长处测定吸光度，代入回归方程，计算得总黄酮含量。

2.2 杜仲黄酮提取方法确定

称取杜仲粉末10 g(过60目筛)，分别采用回流提取法(加60%乙醇200 mL，水浴回流60 min，过滤，提取2次，合并滤液，定容至100 mL)、超声提取法(置500 mL锥形瓶中，加60%乙醇200 mL，室温下超声提取60 min，过滤，滤液定容至100 mL)、微波提取法(加60%乙醇200 mL，在微波功率200 W条件下加热提取120 s，过滤，共提取2次，合并滤液，定容至100 mL)提取，考察提取方法。结果见表2。从总体上比较，微波提取法的提取率最高，回流提取法次之，超声提取法最低。回流提取法由于高温时间长，易溶出杜仲中的蛋白质、糖类等物质，须进一步提纯;超声提取时间较长，功率消耗大，提取率不高。故将微波提取法作为杜仲黄酮的提取方法。

表2 杜仲黄酮提取方法考察结果比较

2.3 微波提取工艺优化

2.3.1 正交试验设计

微波功率主要影响升温速度，功率越大，提取时环境温度升得越快，相对而言，处于较高温度的时间也越长，故提取率也较高。但功率过大易使乙醇爆沸，从而导致挥发过多;另一方面，高温使蛋白质凝固，黄酮不易溶出。因此，微波功率以200 W为佳[4]。通过预试验，选取影响杜仲黄酮提取率的主要因素乙醇体积分数(因素 A)、提取时间 (因素 B)、料液比(因素 C)进行 L9(34)正交试验，因素水平见表3。

表3 因素水平表

2.3.2 试验结果

结果见表4。直观分析可知，微波功率为200 W时，三因素对总黄酮提取率的影响依次为A＞B＞C，即乙醇体积分数＞提取时间＞料液比。最佳工艺条件为A1B2C2，即乙醇体积分数60%，提取时间 10 min，料液比 1 ∶20。

表4 L9(34)正交试验结果

2.3.3 工艺优化

正交试验表明，影响总黄酮提取率最主要的因素是乙醇体积分数，其次是提取时间、料液比。因素C2与C3差异较小，考虑到料液比增加，总黄酮提取率会有不同程度的增加，为提高综合经济效益，将A1B2C3作为最佳提取工艺，即乙醇体积分数60%，提取时间 10 min，料液比 1 ∶30。

2.3.4 验证试验

为进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性，取3份样品，按最佳提取工艺进行验证试验，结果见表5。可见，该优选工艺合理可行。

表5 验证试验结果

3 讨论

与回流提取法、超声提取法相比，微波提取法具有高效性、强选择性、操作简便、活性成分得率高、产物易纯化等特点，可广泛用于各种中草药中黄酮类化合物的提取。

试验结果表明，杜仲总黄酮的最佳提取工艺条件为微波功率200 W，乙醇体积分数60%，提取时间10 min，料液比1∶30(此时总黄酮得率为1.97mg/g)。

[1]孙燕荣，董俊兴，吴曙光.杜仲化学成分研究[J].中药材，2003，27(5):341.

[2]莫开菊，程 超，黄 鹏，等.生姜黄酮提取纯化及结构的初步鉴定[J].食品科学，2005，26(9):229.

[3]仇 燕.菜芙蓉花中总黄酮微波提取的研究[J].中药材，2006，29(4):387.

[4]陈 伟，刘青梅，杨性民，等.微波技术在杜仲黄酮提取工艺中的应用研究[J].食品科学，2006，27(10):285.