骨髓间充质干细胞在中医理论中的归属*

卞 琴，沈自尹，王拥军

1 骨髓间充质干细胞的发现

1867年，德国病理学家 Cohnheim在研究创伤愈合时，提出了骨髓中可能存在非造血组织干细胞的观点。1974年，Friedenstein等证实了这种观点，他们首先报道了骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落，推测这种细胞可能是间质细胞的前体细胞，并将之称为“骨髓多能基质干细胞”［1］。1987年，Owen等在分离培养时发现这些细胞形状呈成纤维细胞样，因而称其为“成纤维细胞集落形成单位”(Colony.forming unifibroblastic，CFU-F)。1988 年，Mamiatopoulos等首次报道鼠骨髓基质在体外培养能形成钙化的骨样组织，经X线衍射分析确定形成的钙化物具有羟基磷灰石结构，证明体外培养的骨髓基质具有成骨能力。1989年，Benakyahu等将MSC体外培养获得具有典型的成骨细胞特性的细胞:具有较高的碱性磷酸酶活性，只产生I型胶原，在条件培养液中可以产生矿化的细胞外基质。1991年Caplan将其命名为骨髓间充质干细胞(MSCs)。随着研究的深入，人们发现其对骨髓血系细胞具有支持诱导作用且又来自骨髓基质，故将其称为“骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell，BMSCs)”。特别是在 1999 年，Pittenger在《Science》上发表文章宣布其分离到骨髓来源的单个 MSC，产生了极大反响，对其认识及研究也更加深入并成为热点。

研究深入后发现，MSC在不同的诱导条件下，具有向中胚层组织细胞分化的能力，故又称其为“间充质干细胞”、“间充质祖细胞”(Mesenchymal progenitor cell)、骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal stem cell)和基质祖细胞(Stromal precursor cell)。2001年 Minguell等将 MSCs概括为:存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，可在体外扩增，体外经诱导后可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌管、神经细胞与支持造血干细胞的基质细胞。

2 骨髓间充质干细胞的生物学特性

2.1 鉴定

目前为止，还没有1个特异性的骨髓间充质干细胞的标志。由于目前相关的命名很多，国际细胞治疗委员会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)推荐命名为“多潜能间充质细胞(multipotent mesenchymal stromal cells，MSC)，并且定义了鉴定 MSC的最低标准，主要包括以下3方面［2］:(1)在正常培养条件下，可以贴附在塑料表面;(2)流式细胞仪检测:＞95%的 MSC群表达CD73(ecto 5’nucleotidase，5’核 苷 酸 酶)，CD90(Thy-1)和 CD105(endoglin，内皮因子);同时，＞98%的MSC不表达造血干细胞表面抗原:CD45(白细胞标志)CD34(造血干细胞祖细胞和内皮细胞标志)、CD11b或者CD14(单核细胞标志)、CD19或者CD79a(B细胞标志)以及HLA家族2;(3)在适当的诱导条件下，具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化的潜能。

2.2 MSC分离

原代MSC的分离主要是利用其黏附在塑料表面的特性，然而这种分离程序相对耗时，无法排除异种细胞的污染。因此，近年也陆续报道了新的分离方法。如利用MSC与细胞外基质的亲和力来分离和扩增，常用的有 I型胶原和纤维蛋白［3、4］。此外，表面抗体也常用来分离 MSC和造血干细胞，包括CD49a、CD 105、Stro-1［5、6］，双标记抗体有 Stro-1 和V-CAM。这些方法比单纯的塑料表面贴壁法得到的 MSC 要多出 1000倍［7］。

2.3 组织来源

除了骨髓来源外，这种多潜能间充质细胞还可从出生后及成人的脐带血、胎盘、外周血、骨骼肌、皮肤、脂肪组织、滑膜、心脏、静脉和动脉壁上分离获得［8、9］。事实上，MSC 几乎存在于胚胎的所有组织中，包括脑、脾脏、肝脏、肾脏、肺、胰脏、胸腺等［10］。除了胎盘和脐带血，皮下脂肪抽吸被认为是获得MSC的另一种简便和损伤性相对较小的方法，且脂肪组织中的MSC比例高。对59位平均年龄49岁的志愿者研究发现，MSC占有核细胞的2%［11］，而在骨髓组织中仅占到0.01%，且MSC在骨髓中的比例与年龄密切相关。出生时MSC与有核细胞的比例是 1∶10000，10 岁左右是 1∶00000，30 岁是 1∶250000，50 岁是 1∶400000，到80 岁是1∶2000000(见图1)［12］。200ml的脂肪抽吸可获得 100万个干细胞，是 40ml骨髓抽吸的 40倍左右［11］。

图1 人骨髓内BMSCs与有核细胞比例随年龄变化趋势

虽然MSC与其他细胞表面抗原没有明显的差异，但是有学者提议全基因表达谱是深入研究MSC特性的有效方法［13］。从脂肪、脐带和骨髓中分离出的MSC，由于个体来源不同，因此许多基因的表达也不同。如骨髓来源的MSC与滑膜来源的MSC进行基因芯片比较后发现，2组表面抗原非常相似，但是268个细胞因子受体转录因子中有46个出现差异［14］。此外，基因表达在MSC传代到3～6代内都保持稳定［15］。

2.4 定向分化诱导剂

成骨细胞:在培养基中加一定浓度的地塞米松、抗坏血酸，beta甘油磷酸盐合用，或者单独加细胞因子BMP2，特异的成骨细胞标志检测包括:茜素红染色、ALP、Cbfa1/Runx2、Osteopontin、Osteocalcin、ColI等。

软骨细胞:3D-藻酸盐培养，在高糖DMED培养基中加入地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸盐、脯氨酸、TGF-beta3、BMP-6。特异的软骨细胞检测标志包括阿尔辛兰染色、aggrecan、ColII、Sox-9 等。

脂肪细胞:过氧化物酶体增殖激活受体gamma(PPARgamma)激动剂(如罗格列酮);合用氢化可的松、异丁甲基黄嘌呤、吲哚美辛。特异的脂肪细胞检测标志包括油红染色、LPL、PPARgamma 等［16、17］。

2.6 细胞株

除了原代MSC外，常用的细胞株有小鼠间充质祖细胞系C3H10T1/2和分化系明确的细胞株如前脂肪细胞 3T3L1、前成骨细胞 3T3-E1［18］。

3 骨髓间充质干细胞在中医理论中的归属

3.1 “髓”

骨髓间充质干细胞的特性之一就是向成骨分化，这一特性与中医“肾藏精，精生髓，髓生骨”的理论有较高的吻合。因为骨髓间充质干细胞主要来自于骨髓(髓)，而在特定环境下能向成骨转化，即实现“髓生骨”。许多补肾药物对 BMSCs的增殖和成骨分化都有促进作用，从而证实了“肾”、“髓”、“骨”之间的关联。“肾主骨”可能是通过补肾药物作用到“髓”中的干细胞，促使其成骨分化来实现的，因此BMSCs属中医“髓”的范畴。

笔者对近5年文献检索结果进行了总结。复方研究发现，补肾壮骨功效的骨康含药血清能抑制BMSCs的成脂化［19］。具有补肝肾强筋骨功效的透骨消痛颗粒含药血清可促进BMSCs向软骨细胞分化［20］。单味中药研究发现，龟板、杜仲的含药血清可以促进BMSCs的增殖，成骨分化有利于细胞脱氧核糖核酸(DNA)合成［21］。有效组分研究发现，龟板中十四酸甾醇酯和十六酸甲酯具有促BMSCs增殖的作用［22］。

3.2 “精”

3.2.1 先天之精 张进等认为，受精卵作为全能干细胞蕴藏了全部先天之精，是精的来源。将全能干细胞与多种成体干细胞的功能与“先天之精”的繁衍生殖、生长发育等功能相比较，“先天之精”与干细胞的基本属性较相似。

具有补肾填精作用的地黄饮子、三甲复脉汤、龟板、刺五加、熟地黄的有效成分地黄多糖可体外诱导BMSCs转分化为神经干细胞、神经元样细胞，阐释了“肾藏精、精生髓、脑为髓之海”的理论(《灵枢·海论》。《素问·五脏生成》:诸髓者，皆属于脑［23、24］。补肾药通过作用于 BMSCs(精)，使其转分化为神经干细胞(精生髓)，即脑髓内神经细胞的来源(脑为髓之海)。

3.2.2 脾肾相关 具有补脾益损功效的强肌健力口服液能促使BMSCs的增殖和向成肌细胞分化，说明 BMSCs来源于先天肾之精，在后天一定条件下可以向“脾”转化［25、26］。补脾法能促使干细胞的生长，为“后天济先天”提供了一定依据。BMSCs可能是“脾肾相关”细胞层次的表达形式，但究其实质仍属于“先天之精”范畴。

3.2.2 精血同源 活血化瘀法对BMSCs的增殖尤其是分化具有促进作用。如具有活血化瘀功效的桃红四物汤，能抑制激素诱导下的BMSCs成脂分化［27］;调节“脑中血海”的中药脑脉 1号，可促进BMSCs向局灶性脑缺血模型大鼠移植后的血管再生［28］;复方丹参注射液可体外诱导大鼠BMSC分化为成软骨细胞、神经元样细胞［29、30］。丹参有效成分丹酚酸B诱导BMSCs向心肌样细胞分化，有效改善BMSCs移植后的血管微环境;其预处理的内皮祖细胞联合BMSCs的移植，促进急性心梗模型大鼠左心室功能的恢复［31～33］。三七有促进 BMSCs增殖并向血管内皮细胞分化的作用［34］;三七总皂苷、参三七皂苷Rg，预适应在体外可显著刺激5-氮胞苷诱导的鼠BMSCs向心肌细胞转化和增殖，改善细胞形态，刺激细胞内钙离子增加，与5-氮胞苷产生协同效应［35、36］。银杏内酯B可促进MSCs向神经样细胞分化，且具有神经元基本电生理功能［37］。

但是关于这部分的理论解释基本是从活血化瘀治疗相关疾病如心梗、脑缺血等角度展开的，没有就BMSCs的作用深入分析。笔者认为，在这些研究中，BMSCs扮演的仍然是“精”的角色，BMSCs取自于骨髓，与造血干细胞是一个来源，这两种干细胞相互影响、相互作用，形成干细胞龛(微环境)。这些活血化瘀中药除了对BMSCs本身具有促进作用外，还改善了其移植后的微环境。虽然实验研究是从BMSCs向其他细胞分化，而不是造血干细胞，但最终改善的都是缺血微环境，因此说“精血同源”。

3.2.3 精气互化 大量的实验发现，具有益气功效的中药复方、单味和有效同样能促进BMSCs的增殖和向其他细胞的分化。如具有益气养阴功效的心复康联合BMSCs移植，较单纯细胞移植对急性心梗大鼠模型具有更显著的保护作用［38］。芪丹通脉片含药血清诱导BMSCs向内皮细胞分化，修复血管内皮细胞凋亡［39、40］。益气活血方可诱导 BMSCs向神经元特异性烯醇化酶细胞和胶质纤维酸性蛋白分化［41］。黄芪含药血清可诱导 BMSCs分化为心肌样细胞、内皮细胞［42］。黄芪甲苷可在体外诱导大鼠BMSCs定向分化为心肌样细胞［43］;人参茎叶皂苷、人参皂苷Rb1对小鼠BMSC具有生长促进作用，并可诱导分化为心肌样细胞和神经元样细胞［44、45］。

但在这些文献中均没有涉及BMSCs的中医归属。《素问·阴阳应象大论》云:“气归精……精化为气。”明·张景岳《类经》注释:“精化为气，谓元气由精而化也……然上文既云气归精，是气生精也，而此又曰精化气，是精生气也。二者似乎相反，而不知此正精气互根之妙，以应上文天地云雨之义也。”说明精、气互化。此理论可解释补气促使 BMSCs(先天之精)转化为五脏(心肌样细胞、神经元样细胞、内皮细胞)之精气。

3.3 移植BMSCs与“热毒”

上述研究大多关注补益药物对BMSCs功能的影响，也包括对BMSCs移植后微环境改变和干细胞本身分化的作用。然而“干细胞移植”在中医理论的概念中是没有的，如果归属可能属“外邪”范畴。由于移植后带来排斥反应的证候类似于温病，因此也属“热毒”范畴。研究发现，具有解痘毒、消炎肿作用的木豆叶含药血清对大鼠BMSCs有促增殖作用［46］。大黄苷元可使脑缺血再灌注损伤大鼠微血管基底膜 ColIV降解减少，通透性降低，并与BMSCs有协同作用，可使其早期的作用提前及中、后期作用增强，其作用机制可能与增加TIMP-1表达以调节 MMP-9 和纤溶酶平衡有关［47、48］。这里的BMSCs与精、髓的关联性都不大。

综上所述，BMSCs在中医理论中归属“精”、“髓”范畴。BMSCs转分化为其他成体干细胞功能与先天之精化生后天之精类似。在此基础上，衍生出“脑为髓之海”、“脾肾相关”、“精血同源”、“精气互化”等。BMSCs主要来源于骨髓，是成骨细胞系的前体，与“髓生骨”较相同。因此，利用国际前沿的干细胞技术如BMSCs研究中医相关理论，将为中医研究打开新局面。

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