Vero及Vero-dst细胞对犬瘟热病毒敏感性比较

任 超，霍桂桃，陈益山，陈 丽，张兰兰，李 佳，陈 武，赵德明

（1.北京农学院，兽医学院（中医药）北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业大学动物医学院，北京 102206）

犬瘟热是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）引发的一种急性、高度接触性致死性传染病。可感染犬科、鼬科、浣熊科、大熊猫科、猫科（猫除外）等多种动物。对我国养犬业、经济动物养殖业、动物园观赏动物和野生动物及实验动物等危害极大。近几年来，在患Paget’s疾病的病人组织中也检出了CDV的核酸［1］。另据Yoshikawa［2］报道猴子对本病也有一定的易感性，提示CDV还存在潜在易感宿主。

CDV病毒的分离培养对诊断和研究该病至关重要。但是由于CDV对外界环境的抵抗力很弱，易被光和热灭活，加之病料采集的部位、时间、样品处理、发病动物的抗体水平等因素致使体外分离培养CDV十分困难，但分离病毒所用细胞的敏感和有效性是成功分离CDV的最关键环节。

本实验选用Vero及Vero-dst两种细胞，接种CDV标准毒株Snyder Hill和临床阳性犬的组织，观察细胞病变（Cyto pathetic effect，CPE）、检测病毒滴度TCID50，并通过RT-PCR法进行比较，观察两种细胞对CDV的敏感性，为CDV的分离鉴定、增殖培养及进一步的深入研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与病毒：细胞系：Vero及Vero-dst（Vero.DogSLAMtag）细胞，中国农业大学病理实验馈赠。犬瘟热病毒Snyder Hill株（ATCC，VR-1587）。犬瘟热病毒野毒株：临床CDV检测阳性犬，于濒死期实施安乐死，无菌采取其肺、肝、脾、肾组织。

1.1.2 主要试剂与药品：DMEM干粉（高糖）：美国Gibico公司（批号1290007）；D-Hank’s干粉：美国Sigma公司（批号1136551）；胎牛血清（FBS）：奥地利PAA公司（批号A04105-1121）；胰蛋白酶：美国Gibico公司（批号2750018）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：培养液为含有90％DMEM，10％FBS的完全培养液，待细胞长至70％～80％的融合状态可接种病毒。将细胞传至第三代，接种病毒。

1.2.2 接种病毒

1.2.2.1 CDV标准株：病毒的复苏：犬瘟病毒Snyder Hill株（Titer：10（4.75）TCID50/0.2mL）置于37℃水浴中迅速解冻，使用维持培养液（98％DMEM为+2％FBS）根据其原始滴度将病毒原液分别按10-3、10-4、10-5进行稀释。按病毒接种的常规方法进行［3］。

1.2.2.2 野毒株：取病料小块组织，按1∶5的比例加入PBS（pH 7.3），同时加入双抗（1000IU/mL青链霉素溶液）充分研磨成匀浆。4℃冰箱内感作2～4h或过夜后5000r/min离心10min，取上清。按上述接毒方法接入状态良好的细胞上，观察CPE。

1.2.3 收毒：反复冻融的方法，即将细胞培养瓶放入-20℃冰箱冻后，直接取出，待其融化为冰水混合物时，使劲摇晃瓶子，让细胞破裂释放出病毒颗粒，反复冻融4次后，将液体移入离心管，2000r/min离心10min，以此除去细胞碎片，离心后收集上清液，即达到收毒目的。

1.2.4 盲传：盲传采用两种方法，一为传统接毒方法，即未出现CPE的细胞仍进行收毒，收集的上清再继续接种下一代细胞。以此盲传5代。仍不见CPE者视为阴性。同时又尝试了另外一种接毒方式，即传代的同时进行接毒，且消化细胞后不弃掉胰酶。

1.2.5 分子生物学方法技术检测感染细胞中的病毒核酸

1.2.5.1 引物的设计与合成：根据Genbank上发表的CDV全序列，在保守区设计了一对引物，扩增片段为178bp。上游引物（P1）：5′-GCCAGACCTGAG GAGTTATTGA-3′，下游引物（P2）：5′-CTGCGTT ACAGACTTGATTTGC-3′。同时，设计了Vero细胞的GAPDH，扩增片段192bp。上游引物（P1）：5′-TCAACAGCGACACCCACTC-3′，下游引物（P2）：5′-CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT-3′。以上引物均由上海生工北京合成部合成。

1.2.5.2 RNA的提取：Trizol法。

1.2.5.3 RT-PCR扩增：提取总RNA后立即反转录获得cDNA，采用全式金反转录试剂盒TransScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix。后将cDNA进行PCR扩增，条件为94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，30cycles，72℃10min，退火温度为53℃。

1.2.5.4 PCR扩增产物的鉴定：琼脂糖电泳鉴定PCR产物。

1.2.6 病毒滴度（TCID50）的测定：用96孔细胞培养板进行毒价测定。将在不同细胞上接种CDV后收获的病毒液分别做10-1～10-10倍梯度稀释，每个稀释度接种8个孔，每孔加入不同稀释度的病毒液100μL。37℃，CO2培养箱培养1h，1h后弃去吸附的病毒液，换为维持液继续培养，逐日观察记录CPE中状况。根据Reed-Munch法计算。

2 结果

2.1 CDV标准株Snyder Hill株在两种细胞中的培养情况（表1及彩插1图1）

Vero-dst cells：第一代即出现CPE，表现为出现合胞体、空泡且细胞变圆、脱落。同时于接毒后6h、12h、18h、24h、36h、48h监测CPE情况，病变约在培养12h后出现，且在24h后病变率为100％。而后继续培养发现细胞全部脱落死亡。

Vero cells：第一代未出现CPE，进行盲传。盲传10代始终未出现CPE，视为阴性。

2.2 野毒在两种细胞中的培养情况（表1及彩插1图1）

Vero-dst cells：第一代即出现CPE，表现为出现合胞体、空泡且细胞变圆、脱落。同时于接毒后6h、12h、18h、24h、36h、48h观察CPE情况，病变约在培养12h后出现，且在24h后病变率为100％。而后继续培养发现细胞全部脱落死亡。

Vero cells：首代未出现CPE，进行盲传。盲传10代始终未出现CPE，视为阴性。

表1 Snyder Hill株与野毒株在Vero-dst及Vero细胞中CPE情况Tab.1 The CPE of Vero-dst cells and Vero cells after infection of CDV

2.3 RT-PCR

CDV标准株及野毒株的Vero-dst细胞培养物中扩增出了CDV基因片段（178bp），而Vero细胞培养物中未扩增出相应基因片段（图2）。

2.4 Snyder Hill株与野毒株病毒毒力测定

经过毒力测定，CDV标准株Snyder Hill株经培养后TCID50为10-4.25/0.2mL；野毒株为10-4.95/0.2mL，由此可见，野毒株毒力比标准株较强。

3 讨论

目前，分离CDV用的组织细胞主要有原代细胞及传代细胞系两大类。原代培养细胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬细胞、肾细胞、胚胎细胞、外周血淋巴细胞、T淋巴细胞、犬脑细胞（DB）、犊牛的肾细胞和T淋巴细胞、牛胚胎肺细胞和鸡胚成纤维细胞（CEF），其中CEF应用最多。其中最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺巨噬细胞进行培养。但由于原代细胞制备过程繁琐且很容易污染，故分离CDV多用传代细胞。分离CDV所使用的传代细胞系有犬肾细胞系（MDCK）、猫胚胎细胞系（FE）、猫肾细胞系（CRFK）、乳仓鼠胎肾细胞系（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）及其克隆株（Vero E6）、BGMK细胞系、绒猴B淋巴细胞系（B95a）、人子宫颈癌细胞系（Hela）、人喉头癌细胞系（HEP-2）、CV-1（Tc7 clone）细胞系、Bsc-1细胞系、兔肾细胞系（RK13）、BD细胞系等。近年来，用Vero细胞分离培养CDV被认为是首选细胞［5］。而据Seki等［6］的研究显示，vero细胞在分离犬瘟热野毒株时并未表现出细胞适性，即未见CPE。另有报道称用vero细胞分离CDV时需要多次盲传并添加胰酶，才有可能出现CPE，这样就给CDV的研究带来不便。在国外某些实验室，他们使用来源于狨猴淋巴细胞的B95a细胞系来分离CDV，实验结果表明此细胞无论在敏感性还是CPE类型上都优于其他细胞，而且分离到的CDV野毒保留了其对宿主动物的致病性。但B95a细胞做为一种被EB病毒转化的细胞系，在操作过程中会释放EB病毒，这就涉及了生物安全的问题，因此该类细胞系难以得到推广应用。

图2 RT-PCR扩增结果Fig.2 The result s of RT-PCR amplification

因此，如何选用敏感细胞是首要的问题。病毒感染细胞的第一步即病毒与细胞膜表面的受体结合，病毒通过细胞表面识别此类病毒的受体粘附于细胞继而侵入细胞，与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制过程中的始动环节，是决定病毒的宿主特异性、组织嗜性及致病性的主要因素之一，即受体决定病毒的细胞嗜性［7］。近年来，信号淋巴激活分子（SLAM，CD150）研究很多，其被认为是麻疹病毒感染细胞时宿主动物识别的细胞受体。有报道称，SLAM（CD150）是CDV等麻疹病毒的受体［8，9］，SLAM（CD150）表达于未成熟的胸腺细胞、激活的T和B细胞及巨噬细胞和树突状细胞表面［10］。而CDV通过识别SLAM（CD150）而进入细胞内复制。而Seki等人［6］的研究也表明应用能够稳定表达犬SLAM的Vero-dst细胞系较Vero或B95a细胞系能快速且敏感地分离出CDV野毒株，因此该细胞系可以用来体外研究CDV野毒株的生物学特性。Wenzilow等［11］的实验通过检测足垫、淋巴结、肺及脑组织，发现患有犬瘟热的病犬各组织中SLAM受体的表达量远高于正常犬，且差异十分显著。同时还发现，在试验感染的犬中，各组织SLAM表达量在感染初期急剧上调。这种受体表达的上调导致了CDV感染更多的敏感细胞，进而使病毒大量增殖，最终引起组织损伤。由此可见，在进行CDV分离或是培养增殖的过程中，SLAM受体无疑起到了至关重要的作用。

通过本实验也可以看出，稳定表达犬SLAM的Vero-dst细胞对于CDV十分敏感，且出现CPE的时间短。而未表达SLAM的Vero细胞始终未见敏感性，这与国外的相关研究一致。

纵观国内许多研究，均提到使用vero细胞可从病料中成功分离到CDV［12-14］，而本研究曾多次反复尝试，均未成功分离，故从本实验中可以看到，目前本实验室所使用的vero细胞在CDV的分离培养中并未表现良好的适应性。由此可见对于病毒体外研究，敏感细胞不可或缺。对于CDV的研究，能够稳定表达犬SLAM受体的细胞系的建立解决了这个问题。从实验结果中可以看出，无论是对分离的CDV野毒株还是增殖培养的CDV标准株，Vero-dst细胞较Vero细胞均表现处理良好的细胞嗜性。对此，国内报道说法不一，且未见将Vero-dst细胞与Vero细胞进行系统比较。

本实验通过Vero及Vero-dst两种细胞对CDV敏感性对比，提示稳定表达犬SLAM的Vero-dst细胞对于CDV较敏感，且CPE出现所需时间短，是分离CDV较为理想的细胞系。

［1］Mee AP，Dixon JA，Hoyland JA，et al.Detection of canine distemper virus in 100％of Paget’s disease samples by in situreverse transcriptase-polymerase chain reaction［J］.Bone 1998，23（2）：171-175.

［2］Yoshikawa Y，Ochikubo F，Matsubara Y.Natural infection with canine distemper virus in a Japanese monkey（Macaca fuscata）［J］.Vet.Microbiol，1989：20：193-205.

［3］傅继华.病毒学实用实验技术技术［M］.山东：山东科学技术出版社，2001：45-50.

［4］殷震，刘景华.动物病毒学（第2版）［M］.，北京：科学出版社，1997：756-760.

［5］Wright NG，Conwell HJC.Canine distemper：current concept in laboratory and clinical diagnosis［J］.Vet Rec，1974，94：86-92.

［6］Seki F，Ono N，Yamaguchi R.Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in vero cells expressing canine SLAM（CD150）and their adaptability to Marmoset B95a cells［J］.Virology，2003，77（18）：9943-9950.

［7］郭爱珍，陆承平.病毒的细胞膜受体［J］.中国病毒学，1997，12（4）：295-301.

［8］Hironobu T，Yusuke Y.The morbillivirusreceptorSLAM（CD150）［J］.Microbiol Immunol，2002，46（3）：135-142.

［9］von Messling V，Svitek N，CattaneoR.Receptor（SLAM［CD150］）recognition and the V protein sustain swift lymphocyte-based invasion of Mucosal tissue and lymphatic organs by a morbillivirus［J］.J.Virol，2006，80（12）：6084-6092.

［10］赵建军，张海玲，高晗.狐、貉和水貂犬瘟热病毒受体SLAM的基因克隆及其真核表达［J］.兽类学报.2010，30（1）：79-86.

［11］Wenzlow N，Plattet P，Wittek R，et al.Immunohistochemical demonstration of the putative canine distemper virus receptor CD150 in dogs with and without distemper［J］.Vet Pathol，2007，44：943-948.

［12］张洪英，司徽，高艳.犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定［J］.中国预防兽医学报.2007，29，8：579-583.

［13］肖定福，张汇东，温海.犬瘟热病毒的分离鉴定［J］.中国兽医杂志.2007，43（1）：38-42.

［14］闫喜军，柴秀丽，罗国良.貉犬瘟热病的分离与鉴定［J］.特产研究.2006，4：1-3.