金黄色葡萄球菌小菌落突变株研究进展

刘修权,曲伟杰,高 健,王 志,Rashad Abdulkarim Alkasir,苏敬良,韩 博

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀100193;2.云南农业大学动物科学技术学院,云南 昆明650201)

Jacobsen(1910)分离到一种异常的伤寒埃伯泽氏菌株,并依其特殊的表型特征命名为小菌落突变株(small colony variants,SCVs)[1]。自此,人们开始了对SCVs的研究。深入研究发现,许多细菌(如表皮葡萄球菌、头葡萄球菌、绿脓杆菌、洋葱伯克氏菌、霍乱弧菌、志贺氏菌、羊布鲁杆菌、大肠埃希氏杆菌、乳酸杆菌、粘质沙雷菌及淋病奈瑟氏菌等)都具有形成这种小菌落突变株的能力,并先后从脓肿、血液、骨骼、关节、呼吸道和软组织中分离到 SCVs。Jensen(1957)首次报道了金黄色葡萄球菌小菌落突变株(SASCVs)[2]。目前,SASCVs的研究最为广泛深入,现已将其作为研究SCVs的模式微生物。

1 SASCVs形成的生化机制

SASCVs最为典型的特征是菌落细小,仅有其野生株菌落大小的1/10左右。此外,与典型的金黄色葡萄球菌相比,它们还具有色素生成和溶血能力降低、凝固酶形成迟缓等异常的生理生化特性。所有这些表型的出现,可归因于SASCVs缓慢的生长速度。基于此,早期人们对SCVs的研究主要集中于探索其营养缺陷型,试图阐明SCVs生长缓慢的机制。其中经典的方法就是“化学限定培养基补偿试验”,以SASCVs的回复性来判断其具体营养缺陷类型。后来,人们陆续发现了一些化合物能促使SASCVs恢复到正常的表型[3],而这些化合物多为野生株的次级代谢产物,包括不饱和脂肪酸、CO2、甲萘醌、血红素和硫胺素。其中,甲萘醌、血红素和硫胺素的作用最大,绝大多数SASCVs都是此3种物质的特异营养突变株。

SASCVs与其亲本株相比,其氧化磷酸化的能力明显降低。由此,人们从生物能角度出发,为SASCVs的研究掀开了崭新的一页。近年来,人们对细菌新陈代谢及生物能的理解日益加深,最近研究表明,SASCVs实质上是一种电子传递链缺陷型突变株。

S.aureus主要的产能方式是需氧呼吸。它通过多重酶促反应利用内、外源营养物质而生成NADH、FADH2等还原性物质,并将携带的氢原子以质子和电子的形式在呼吸链上传递,同时也会逐步释放能量以偶联的方式生成ATP。呼吸链是由NADH脱氢酶、黄素蛋白、铁硫蛋白、细胞色素、醌及其衍生物组成并按氧化-还原电位由高到低的次序不对称排列的多酶氧化-还原体系。呼吸链的完整性是其发挥正常功能的基本前提。一旦某一组分功能丧失或降低,势必造成连锁效应使下游酶促反应中止,致使整个呼吸链处于瘫痪状态。这样,细菌ATP合成受阻,菌体可利用的能量不足,生长速度减慢,进而形成SCVs表型。

尽管细菌多种新陈代谢的改变都能引起生长速度缓慢,但到目前为止,SASCVs临床分离株多数是由于呼吸作用时合成能量不足所致,主要表现为与呼吸链相关的特异营养缺陷类型。依呼吸作用时ATP的生成过程不同,可将SCVs分为两种营养缺陷类型,即电子传递链缺陷型和胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型。

电子传递链缺陷型是最典型的SASCVs营养缺陷类型,具有菌落细小、色素生成能力降低和不发酵甘露醇等特征。大量报道指出,在化学限定培养基中加入甲萘醌或血红素时,此类SASCVs可以恢复至野生株表型,表明此类SASCVs是由于甲萘醌或血红素合成障碍所致。甲萘醌和血红素合成受阻导致SASCVs表型的机制如下:首先,甲基萘醌是细菌合成辅酶Q(CoQ)的前体物质,而CoQ则能从NAD+脱氢酶系、FAD等接受电子,并将获得的电子传递给呼吸链的另一重要电子载体(QH2-细胞色素c还原酶复合体);其次,血红素种类颇多,它们是多种呼吸酶的功能单位。可见,如果甲基萘醌或/和血红素的合成受阻,将会中止呼吸链,造成ATP合成不足使细菌呈现SCVs表型。鉴于此,可以将此类电子传递链缺陷型SASCVs进一步分为甲萘醌营养缺陷型和血红素营养缺陷型。此外,硫胺素生物合成受阻也会导致SASCVs表型,称之为硫胺素缺陷型SASCVs。不过,因为细菌在合成甲萘醌时,严格需要硫胺素的参与,故普遍认为该型SASCVs是甲萘醌缺陷型SASCVs的一个亚型。

胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型SASCVs的表型与电子传递链缺陷型基本相同,但这种SASCVs的形成机制至今尚未明确。正常的金黄色葡萄球菌能够分泌大量的DNase,可分解脓汁中的DNA释放胸腺嘧啶脱氧核苷供其利用来维持野生表型,但仍能从其中分离到这种SASCVs。鉴于此现象,有人提出“双重突变子假说”来阐释胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型SASCVs的形成机制。该假说认为:此类SASCVs对外源胸腺嘧啶脱氧核苷吸收受阻,可能是由于其膜上的胸腺嘧啶脱氧核苷载体蛋白突变所致。Saxild等和Smith等研究指出,金黄色葡萄球菌胸腺嘧啶脱氧核苷的摄入依赖于一种电化学梯度依赖性的跨膜蛋白-NupC,且这种蛋白在金黄色葡萄球菌仅有一种,而电化学梯度的维持需要ATP水解释放能量来完成[4-5]。这样,金黄色葡萄球菌SCVs由于能量不足使DNase合成量下降,同时NupC蛋白功能也受到限制,进而外源胸腺嘧啶脱氧核苷利用受阻而使ATP合成量降低。反之,ATP合成受限亦会加剧DNase合成量的下降并影响NupC蛋白作用,使菌体能量更为不足,最终形成SCVs。

事实上,多种物质的合成受阻都可能引起金黄色葡萄球菌形成SASCVs。除了上述两类SASCVs外,人们相继报道了一些其他类型的SCVs营养缺陷型(如CO2营养缺陷型[6-7]),还有一些营养缺陷不明的SASCVs分离株。鉴于此,Proctor等人推测,F0F1-ATPase及细胞色素等物质合成缺陷,虽不会导致细菌甲萘醌和血红素合成受阻,但却同样可使呼吸链瘫痪而形成SASCVs表型[8]。

2 SASCVs形成的遗传学机制

SACVs与其亲本株可同时出现在同一病料中,而SASCVs可以快速回复成野生株表型,且这种转化在体内外均可进行。鉴于此,Proctor等提出SCVs的形成是在菌体内基因调控系统的作用下实现的[8]。不过,采用脉冲场凝胶电泳技术对SCVs及其亲本株分型表明,二者的电泳图谱却不尽相同[9]。因而,随机突变、类似于大肠杆菌一型菌毛的“相变异”等基因改变可能是SASCVs形成的主要原因所在[10]。

虽然临床上有许多SASCVs分离的报道,但想要确切定位SASCVs临床分离株基因突变位点绝非易事。许多研究已经证明,SASCVs的出现与呼吸链受损有关。故而,可以通过化学限定培养基补偿试验确定其属于何种物质的营养缺陷型,然后结合分子生物学原理和技术对基因突变进行检测。例如,为甲萘醌缺陷型SASCVs补充氧琥珀酰苯酸盐能使其恢复至野生表型,而补充异分支酸盐则不然,由此可知甲萘醌生物合成途径受阻部位在这两种物质之间。目前,已经报道多种基因(ctaA、menB、menD 、hemA 、hemB 、hem H 、mutS 、f usA 、thyA)的突变均能导致S.aureus出现SASCVs表型。

SASCVs临床分离株有时可表现为多种营养缺陷共存,且表型多不稳定。为了研究的需要,近年来研究者们建立了几种表型稳定的S.aureus基因缺失株,如hemB缺失株、menD缺失株和thyA缺失株,它们都具有SASCVs临床分离株的典型特征。在此基础上,人们对SASCVs进行了更为深入广泛的研究。Sifri等(2006)用hemB和menD缺失株建立了秀丽线虫感染模型并对SASCVs的毒力进行了研究[11]。Kohler等(2003)应用二维电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术,从蛋白组学水平对hemB突变株代谢途径进行了研究[12]。Atalla等(2009)以牛源 SASCVs分离株(Heba 3231)和牛源S.aureus Nowbould株及其hemB缺失株诱导试验性奶牛乳房炎,并对其体细胞数和临床症状进行了研究[13]。von Eiff等(2006)对hemB、menD基因缺失株及其亲本株的表型矩阵进行了比较研究,其结果表明,两者均对多种碳源的利用受阻,其中menD对碳源利用的受阻最为严重;在呼吸量瘫痪时,生成ATP的磷酸己糖等糖水化合物能刺激二者的生长;两者对亚硒酸盐、亚碲酸盐及硝酸盐的敏感性较高[14]。Brouilllette等(2004)对牛源S.aureus Nowbould株及其hemB缺失株诱发的小鼠乳房炎的抗药作用进行了研究,结果表明,SASCVs表型可能是金黄色葡萄球菌在抗菌药作用下体内持续感染的主要原因之一[15]。

3 SASCVs与疾病的关系

1980年,人们首次证明SASCVs与人类的许多疾病相关[16]。Proctor等(1995)从5名S.aureus慢性或复发性感染病人分离到5株SASCVs,提出“SASCVs与慢性或复发性感染有关”的假说[3]。此后,人们才意识到SASCVs对持续性或复发性感染的具有重要意义,并展开相关性研究。迄今为止,临床上报道的与SASCVs有关的疾病多种多样,其中以纤维囊化症最为常见。此外,已报道的与SASCVs相关的疾病还包括锁骨关节炎、慢性骨髓炎、艾滋病继发感染、疝切开术术后创口感染、脑水肿、起搏器植入引起的血源性感染、脑室腹膜分流术继发感染、假肢移植感染、慢性软组织感染、中耳炎、支气管炎、腹膜炎及败血症等。

如上所述,SASCVs在人医上报道相对较多,其对慢性感染疾病的重要意义已基本达成共识。然而,SASCVs在动物疾病方面的研究却相对滞后,与奶牛乳房炎相关SASCVs的报道更为匮乏。Sompolinsky等(1974)在以色列的某牛场中,发现SASCVs与慢性乳房炎有关[17]。Atalla等(2008)首次报道从11头慢性乳房炎患牛乳汁中分离一株表型稳定的SASCVs,并对其生化特征、内皮细胞内持续及基因转录谱等方面的特性进行了研究,表明SASCVs可能是慢性乳房炎持续的一个主要原因[18]。此后,又对SASCVs株及人工基因缺失SASCVs进行了其他相关研究。

4 诱导SASCVs产生的因素

S.aureus基因具有极大的可塑性,在自然选择作用下,能自发形成SASCVs。在此过程中,抗生素的长期使用及宿主的免疫机制起着至关重要的作用。首先,临床上分离到的SASCVs多是胸腺嘧啶核苷合成缺陷型和电子传递缺陷型两大类。前者主要出现在长期应用复方新诺明等磺胺类药物的病例,主要是因为复方新诺明能够阻止四氢叶酸的合成,而四氢叶酸是胸腺嘧啶核苷酸合成酶(催化dUMP转化为dTMP,而dTMP是合成DNA的原料)的一个辅基。后者却与氨基糖苷类抗菌药物的使用密切相关。不论体内外,在氨基糖苷类药物存在的情况下,S.aureus形成SCVs的概率均显著提高。Pelletier等也报道,Lg7.0CFU的S.aureus野生株在含有1 μ g/mL的庆大霉素培养基上培养48h,能形成 SASCVs[19]。此外,Atalla等研究发现,庆大霉素能诱导牛源性S.aureus野生株转化为表型不稳定的SASCVs[18]。氨基糖苷类对SCVs的筛选作用可能与细菌30 S核糖体亚基校正功能丧失有关:氨基糖苷类药物与30 S核糖体亚基结合后,改变其校对功能,导致蛋白质的错误翻译而使表型改变。一些特殊蛋白质(如DNA聚合酶Ⅲε亚基)的错误翻译又进一步使DNA聚合酶Ⅲ碱基校对功能降低或丧失而导致增突变基因表型的出现。与此同时,蛋白质的错误翻译还可激活应激性诱变途径。然而,氨基糖苷类药物诱导SCVs的确切机制至今仍未阐明,有待进一步研究。

其次,胞内环境也有利于SASCVs的选择和存活。体外培养的内皮细胞的胞内环境能选择自然形成的SASCVs,而S.aureus野生株侵入原代牛乳腺上皮细胞后,对细胞裂解物的培养可形成亲本株与SCVs表型的混合菌群。

再者,Mitchell等最近报道,含有绿脓杆菌4-羟基-2-庚基喹啉氮氧化物(HQNQ)的培养基上清液能诱导S.aureus形成SASCVs,继而形成生物被膜。进一步研究还发现,HQNQ存在时,б因子B亦受到激活,同时附加基因调控系统(accessory gene regulator,AGR)则受到抑制;无HQNQ时,则不然。因而,Mitchell等指出绿脓杆菌HQNQ通过激活金黄色葡萄球菌б因子B而使其形成SASCVs和生物被膜[20]。

5 SASCVs的分离鉴定及培养

SASCVs特殊的表型和生理生化特征使其分离、鉴定及药敏试验变得尤为困难,给微生物研究及医务工作者带来了严重挑战。SASCVs菌落形态异常,生化反应丧失或降低,传统的实验室技术对SASCVs的分离鉴定效果很不理想。因而,探索SASCVs分离鉴定技术势在必行。Kipp等(2005)报道,采用哥伦比亚血琼脂培养基和一种新型的显色培养基(S.aureus ID agar)可大大提高SASCVs的分离培养率[21]。SASCVs的分裂速度比其野生株慢9倍,当野生株与SCVs共存培养时,野生株的过度生长会造成SCVs的丢失而呈现假阳性,而应用PCR技术检测金黄色葡萄球菌一些种间特异基因(如nuc、coa等)可进一步确实检测结果。此外,Kipp等报道,应用16S rDNA原位杂交技术检测一例脑水肿患者病料,检测出S.aureus后又经延时培养,最终分离到1株SASCVs[22]。

6 SASCVs耐药机制

目前,抗生素仍是治疗细菌性感染的首选药物。然而,与其亲本株相比,临床上分离的SCVs对抗生素的耐药性更为严重。首先,膜电势(△Ψ)能够促进细菌对氨基糖苷类抗生素的摄入。SASCVs由于ATP合成不足,无法维持正常的膜电势,导致氨基糖苷类抗生素无法进入细菌胞质发挥其作用,从而造成SASCVs的耐药性。SASCVs对阳离子多肽的耐药性机理也与此类似[23]。其次,SASCVs生长缓慢,细胞壁分裂能力降低,因而β-内酰胺类等作用于细胞壁的抗菌作用降低。最后,SASCVs能存活于多种特异及非特异的吞噬细胞,并调停免疫反应,从而达到规避多种抗生素作用的目的。

另外,由于SASCVs临床分离株生长缓慢,且多与其野生株共存。因而,在常规药敏试验中,一方面,会因培养时间过短而造成假阴性;另一方面,临床上它们多与野生株呈异质性,共同培养时易被其野生株的过度生长而掩蔽,导致药敏试验呈假阳性。鉴于此,为了弥补常规药敏试验的不足,探索若干有效的耐药性检测技术(如PCR检测耐药基因等)显得尤为重要。

7 SASCVs感染的治疗

由于SASCVs与多种持续性感染密切相关,要对其彻底治愈,必须研究合适的药物及给药方式。然而,目前尚无清除 SASCVs的特效药的报道。Kipp等(2003)报道,将万古霉素、利福平及替考拉宁配伍使用而彻底治愈一例由SASCVs感染所致的脑水肿[22]。Baltch等报道,将达托霉素、利福平及庆大霉素合用、达托霉素-利福平及庆大霉素-利福平配伍使用对清除人单核细胞源性巨噬细胞内的SASCVs效果最为明显,而在液体培养基中,单独使用达托霉素、达托霉素-庆大霉素配伍、利福平-庆大霉素配伍及三者配伍,它们对SASCVs的清除效果相近[24]。Baltch等(2009)对达托霉素抗SASCVs的疗效进行研究指出,达托霉素可用于治疗SASCVs所致的慢性或复发性感染[25]。SASCVs所致的慢性感染治疗极为棘手,因而,有必要探索合适的给药方式,研发疗效更为明显的抗菌药物。

8 结语

由于呼吸链瘫痪,S.aureus会形成具有特殊表型的SCVs。这种SASCVs能侵入多种特异或非特异吞噬细胞引起慢性或复发性感染,其临床SASCVs分离株多数是甲萘醌、血红素或硫胺素的营养缺陷体,对多种抗生素产生耐药性。目前的研究表明,基因突变是造成S.aureus呼吸链瘫痪的遗传学基础。因而,检测SASCVs临床分离株突变基因,可以加深人们对SASCVs新陈代谢及毒力因子表达等方面的机制的了解,对解决金黄色葡萄球菌慢性感染性疾病具有重要的意义。

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