牛乳中β-内酰胺酶的检测方法研究进展

张鑫潇，谢岩黎，王金水，严瑞东

（河南工业大学粮油食品学院，郑州450052）

牛乳中β-内酰胺酶的检测方法研究进展

张鑫潇，谢岩黎，王金水，严瑞东

（河南工业大学粮油食品学院，郑州450052）

β-内酰胺酶可以水解生鲜奶中β-内酰胺类抗生素，使检测方法无法正确判断其是否为“无抗奶”，掩盖抗生素超标的事实。对牛乳中β-内酰胺酶的结构、残留的现状和危害、检测方法的研究进展进行综述。

β-内酰胺酶；生鲜奶；检测方法

0 引言

奶制品中抗生素残留的问题是牛奶及其制品质量安全中的重点问题。有关抗生素残留的检测方法日趋完善，但是一些不法分子为了逃避抗生素的检测，向牛奶内添加β-内酰胺酶（β-lactamase），可以使β-内酰胺类抗生素如常用的青霉素降解，使微生物法、酶联免疫法等常规的检测方法失效，从而无法正确判断是否为“无抗奶”，掩盖抗生素超标的事实。

2009年2月4 日，根据卫生部等九个部门《关于开展全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知》的规定，为配合全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治工作的深入开展，专项专家委员会提出《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》，其中就包括β-内酰胺酶。

1 牛乳中β-内酰胺酶潜在危害及残留现状

β-内酰胺酶是细菌产生的一种能水解β-内酰胺类抗生素的酶。已发现二百多种β-内酰胺酶。其中比较有代表性的青霉素酶，即能催化水解青霉素β-内酰环产生青霉噻唑酸的一类β-内酰胺酶。青霉素酶根据Bush-Jacoby-Medeiros最新分类法[1]，以底物谱和抑制剂不同可分为四组，按各自氨基酸和核苷酸序列属于A、B、C、D四类。第一组为头孢菌素酶（AmpC酶），不被克拉维酸抑制，分子类别属于C类，本组酶大部分由染色体介导，也可由质粒介导[2-5]；第二组β-内酰胺酶数目最多，如青霉素酶和超广谱酶，可被克拉维酸抑制，多由质粒介导，其中除碳青霉烯类水解活性分属2 d亚组为D类，其他皆为A类；第三组为金属β-内酰胺酶，分子类别为B类，不被克拉维酸抑制，但可被EDTA抑制；第四组为其它不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶，分子类别未定[6]。现今已分离出多种类型的青霉素酶，白色粉末状，分子量50 ku，溶于水，酶溶液易失活，酶反应最适pH值为6.0～6.5，以青霉素G钾盐为底物，酶促中反应速率为半最大值时，底物浓度为4.32×10-3mol/L（5/B酶），4.89×10-3mol/L（569酶）。医疗上用于青霉素过敏症的治疗，在实验中青霉素酶用于破坏或抑制青霉素活性。

在β-内酰胺类抗生素大量存在的环境中，有些微生物可以产生β-内酰胺酶[7]，催化β-内酰胺开环降解，使抗生素水解失活[8]。因此，细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性，主要是细菌在接触药物后，通过质粒或染色体介导发生基因突变产生的[9]。但是由此产生的β-内酰胺酶含量很低，在不人为添加β-内酰胺酶的条件下是无法检测到微生物产生的β-内酰胺酶的。究其原因可能是由于采奶方式、牛奶的组分、消毒方法和包装储存方法等不适于产β-内酰胺酶微生物的生存，基于目前科研的认识和实践，牛奶中检出的β-内酰胺酶是人为添加[10]。

有观点认为，正是假“无抗奶”的存在催生了国家严禁“无抗奶”标识政策的出台。β-内酰胺酶的使用会助长牛奶生产中β-内酰胺类抗生素的滥用，然而β-内酰胺酶残留危害如何如今还未定论。

β-内酰胺类抗生素以青霉素为例，青霉素的过敏反应非常普遍，约0.7～10%的患者对青霉素过敏，占过敏病人的74%。过敏反应是青霉素中所含的一些杂质引起的，引起过敏反应的基本物质有两种，一种是青霉素裂解生成一些青霉噻唑酸，与蛋白质结合形成抗原而致敏。另一种过敏源是一些高聚物，为β-内酰胺环开环后自身聚合而成，聚合程度越高，过敏反应越强。而青霉素在β-内酰胺酶作用下，酶中亲核性基团向β-内酰胺环进攻，开环后可脱羧重排生成中间体青霉噻唑酸[11，12]。虽然由于添加β-内酰胺酶造成青霉素过敏的病例并未被研究证明，但根据青霉素的过敏机理，以及β-内酰胺酶的添加可能会造成β-内酰胺类抗生素耐药性的原因，确实应该对β-内酰胺酶的滥加提高警惕，严加管理。

由于抗生素残留的普遍性，而国家又明文规定了抗生素残留不能超量，“无抗”又成为乳制品的重要质量指标，因此出于逃避检测等各种目的，假“无抗奶”的出现令人担忧[13]。中国药品生物制品检定所的崔生辉等人在2006年对从零售市场上随机采集的5个厂家生产的38份牛奶样品进行了分析，结果38份市售牛奶样品63.2%(24/38)检出β-内酰胺酶[14]。由此可见β-内酰胺酶的滥用情况非常普遍。

2 β-内酰胺酶的检测方法

2.1 微生物法

用微生物法对β-内酰胺酶检测，最先是在临床医学上应用的。

临床微生物实验室为了了解细菌的耐药机制及指导临床合理使用抗生素、延缓细菌耐药性的产生、控制耐药菌株的播散和流行以及研究、开发新型、稳定和高效的抗生素，采用了多种微生物法对产β-内酰胺酶的耐药菌株进行密切监测[15]，主要方法有：显色培养基法[16]、三维试验法[17]、纸皮扩散确认法[18]、聚合酶链式反应法[19]等。

2007年中国药品生物制品检定所的崔生辉等人通过青霉素分解实验和蛋白电泳实验分析“生鲜牛乳抗生素分解剂”的有效成分，结果证实β-内酰胺为其主要的成分。然后运用β-内酰胺酶特异性抑制剂舒巴坦建立了该酶的检测方法。该方法在牛奶中的检出限为4 U/mL β-内酰胺酶[14]。其所用的方法主要是运用微生物培养法，基本原理是利用克拉维酸、舒巴坦的特异性抑制β-内酰胺酶的特点做细菌培养，通过测量抑菌圈得出结果。该方法可以检测出牛奶中未反应完全（未失活）的β-内酰胺酶，可用于检测未经过任何加工的牛奶。检出限较低。北京先驱威峰技术开发公司开发的ZY-400系列β-内酰胺酶测量分析仪也是根据微生物培养法的原理检测乳与乳制品中的舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质。

2.2 碘量法

碘量法是氧化还原滴定法中，应用比较广泛的一种方法。β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中心,其性质活泼,是分子结构中最不稳定的部分,其稳定性与含水量和纯度有很大关系，β-内酰胺环不稳定是因为，元环张力大和内酰胺键易水解[19]。利用青霉素分子不消耗碘,而其降解产物青霉噻唑酸消耗碘的性质,采用碘量法测定。

Sykes和Nordstrom用碘量法检测β-内酰胺酶的活性，脱色反应缓慢，青霉素需反应彻底，15～20 min后达到稳定状态，并检测该反应过程的吸光率变化，该实验的检测限可以达到0.001 U[20，21]。南昌大学的薛哲等人在对β-内酰胺类抗生素对热的稳定性的研究中，利用青霉素或头孢菌素不消耗碘，而其降解产物消耗碘的性质，采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量[22]。

北京六角体科技发展有限公司β-内酰胺酶快速检测试剂盒原理为牛奶中的β-内酰胺酶与试剂反应后产生的水解物，再与鉴别试剂反应，观察是否生成蓝色物质，可以鉴别牛奶中是否含有β-内酰胺酶，只适用于生鲜奶，检测下限为50 U/mL以上（酶活性）。

碘量法可检出牛奶中已反应及未反应的β-内酰胺酶，可用于检测鲜奶及奶制品中的β-内酰胺酶，检出限较高。

2.3 酸测定法

是根据青霉素或头抱菌素经β-内酰胺酶作用产生裂解酸引起pH值变化,使指示剂色变或碳酸钠溶液释放出二氧化碳的压力变化及以碱滴定来设计的。

Richard J.Henry和Riley D.Housewright[23]早在1946年的时候利用压力测量计，根据青霉素酶分解青霉素产生中间产物青霉酸，然后分解得二氧化碳和青霉噻唑酸的原理，测得二氧化碳的变化量计算β-内酰胺酶的含量。

在医学和兽药研究方面，酸测定法应用于对阿莫西林、氨苄西林等β-内酰胺类抗生素耐药菌株的检测。张春辉、张晓根与胡功政以酚红为指示剂，用酸测定法对耐药菌株检测，阳性率为97%[24]。

首都师范大学化学系的马洁与李孝君等人，根据酸测定法原理，利用酸度计检测牛奶中β-内酰胺酶的残留量。该方法在磷酸缓冲液和牛奶中，对β-内酰胺酶的检出限分别为10 U/mL和15 U/mL，同时得到的米系常数为0.0351 mmol/L[25]。

2.4 液相、气相法检测

卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》中包括β-内酰胺酶，其检测方法是由中国检验检疫科学院食品安全所提供，推荐使用液相色谱法。

在β-内酰胺类抗生素生产过程中，需对副产物青霉噻唑酸加以控制，利用高效液相色谱法可以直接检测重组菌中是否含有青霉素酶。中国科学院大连化学物理研究所的赵静枚、都绛瑛与张铭俊利用高效液相色谱法对青霉噻唑酸进行了液相色谱的定性检测，结果表明实验方法简便快速，结果准确[26]。

农业部食品质量监督检验测试中心的韩奕奕与王建军等人，用加标的方法制备含不同浓度β-内酰胺酶的还原乳，气相色谱-质谱联用法按国标GB/T22388-2008操作。用SNAP双流向酶联免疫间接检测法对牛奶中β-内酰胺酶的检测限可以达到0.0005 U/mL和0.001 U/mL。此法可以作为快速检测牛奶中β-内酰胺酶的快快速筛选方法，有较高的精确度和灵敏度[27]。

3 β-内酰胺酶检测的研究现状及展望

β-内酰胺酶的检测方法有微生物法、分光光度法、高效液相色谱法、气质联用法等。微生物法周期长，分光光度比色法易受干扰，酸测定法中，根据压力变化测定的检测法费时冗长、操作较繁,影响因素多,又需特殊设备,很少使用。而利用pH值变化测定的检测法则简单易行,重复性较好,最易获取结果,且较灵敏,稳定性好,但也存在假阳性和假阴性的问题，适用于大多数实验室，特别是基层检测。液相色谱和气相色谱法是国标，具有检测精度高,检测限低，重复性好的优点，但是也存在样品前处理步骤繁琐、费时、检测仪器昂贵、周期长、成本高，且依赖专业技术人员等问题，不利于基层质检部门作为大面积初筛、不利于现场快速检测和监督，也不利于指导消费者家庭内对牛奶的选择性识别。建立一种简便、快速、高效、成本低廉β-内酰胺酶试纸检测技术具有重要意义。

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Research on analytical methods of β-lactamase residue in milk

ZHANG Xin-xiao，XIE Yan-li，WANG Jin-shui，YAN Rui-dong
(School of Food Science and Technology Henan University of Technology,Zhengzhou 450052，China)

β-lactamase can hydrolyze β-lactam antibiotics,which cause failure analysis of antibiotics.Then we can't estimate which is antibiotic-free milk.This paper reviews the construction,current residue situation,hazard and the methods of identification.

β-lactamase；Raw milk；Analytical methods

TS252.7

B

1001-2230（2011）02-0045-03

2010-05-24

张鑫潇（1986-），女，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。