H.E染色和普鲁氏染色在动物铁过负荷诊断的比较

江苏畜牧兽医职业技术学院 张 静

动物铁中毒主要表现为呕吐、腹痛、腹泻、急性肠坏死等。其原因在于动物的肠屏蔽功能不能有效防止铁的过量吸收。研究表明，猪仔体内含铁量超过400 mg/头时会导致死亡；绵羊若含铁量2.5 g就会引发急性铁中毒，0.5 g/kg则会导致瘤胃弛缓、腹泻以及肾机能障碍，慢性中毒的绵羊3周内就会死亡。当前随着养殖业的发展，饲料中添加铁制剂成为一种常态，动物铁中毒或者铁过负荷的现象时有发生。诊断和解决动物铁中毒和铁过负荷成为当前养殖业发展的需要，然而针对铁过负荷和铁中毒的研究却非常稀少，本试验研究比较了铁过负荷猪的脏器H.E染色和普鲁氏染色变化。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验材料 10头临床诊断判定为铁过负荷病猪。

试验材料：Leica冰冻切片机、PM-10AD显微镜、数码相机。实施H.E染色以及普鲁氏染色法所需要的各种器皿以及药品。

1.2 试验方法 采用病理解剖学观察法：（1）解剖并取该淋巴结，将其被膜上的脂肪组织剥除，接着将脂肪组织切片，在生理盐水中洗涤后取图像。（2）将其放入由50 mL浓度为5%的亚铁氰化钾和50 mL相同浓度的盐酸配置成的普鲁氏兰染色液中进行15 min染色，当淋巴结出现蓝色反应时将其取出并冲洗，吸水纸吸干水分后观察和采集图像。（3）分别采用淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏的组织块，用生理盐水洗涤，然后借助Leica冰冻切片机专有的组织粘附剂将上述各个组织块粘在冻头上，并在-25℃进行切片，每一切片的厚度为5 μm。切片成功后将其放在干净的载玻片上并即刻用100 mL/L的福尔马林固定30 s左右，然后再用浓度为950 mL/L的乙醇再固定30 s。每种脏器都要做两组切片，其中一组切片用H.E染色，另一组用普鲁氏染色。最后用酒精脱水后并采用中性的树胶封固切片，之后移至显微镜下进行观察并采集图像。

2 结果与分析

2.1 病理解剖学变化 铁过负荷机体内的淋巴结的颜色随着铁过负荷程度的不同而呈现出从棕黄色到棕褐色的不同色泽。铁过负荷程度越高，其在普鲁氏染色之后呈现的蓝色越深，反之铁过负荷程度越低，其呈现出的蓝色越浅。

2.2 组织病理学变化

2.2.1 淋巴结 通过对H.E染色标本观察可知，病变之后的淋巴结被膜、小梁、实质、淋巴小结、髓索以及髓窦内巨噬细胞的数量剧增。在淋巴结的副皮质区内可以明显观察到网状细胞和淋巴细胞的数量减少，巨噬细胞数量增加，增加幅度甚至高达原来的几十倍。巨噬细胞的细胞质内含有铁血黄素颗粒，这些颗粒的数量不等，颜色呈棕黄色。但是由于巨噬细胞吞噬了大量的铁黄素颗粒，因此体积增大导致正常形态受损难以被识别。而在普鲁氏兰染色标本中，可以观察到巨噬细胞呈现出由淡蓝色到深蓝色的不同颜色，而且其数量也比H.E染色多，所在位置也以周围的淋巴组织和淋巴窦为主，被膜、小梁和淋巴结内的数量则相对少一些。巨噬细胞大量集结在一起无法识别其清晰的轮廓，但是单独存在的巨噬细胞还是比较清晰的并能够识别。

2.2.2 脾脏 H.E标本中的巨噬细胞数量明显增多，体积变大，含有大量的铁黄素颗粒。分布区域主要是边缘区和脾索内，其次是脾血窦和动脉周围的淋巴组织鞘。普鲁氏兰染色标本巨噬细胞的分布位置与H.E标本大致相同，但前者巨噬细胞的数量更多而且更加清晰。巨噬细胞的体积随着铁黄素颗粒数量的增多而增大，颜色也随之变深。

2.2.3 肝脏 肝脏组织的H.E标本中枯否氏细胞数量大量增加，而且在其细胞质内可见铁黄素颗粒肝细胞出现空泡变性症状。普鲁氏兰染色标本中的枯否氏细胞数量较前者更多，而且由于细胞都被染成蓝色因此更易观察和辨识。在肝脏的叶下静脉中可以清晰地看到内含铁黄素颗粒的单核细胞，而这些单核细胞也可能是被肝脏转移的细胞。同时可以观察到肝细胞内也有大量被染成蓝色的铁黄素颗粒。

2.2.4 肺脏 肺组织H.E标本中，可以在肺泡膈中看到肺巨噬细胞和肺泡巨噬细胞的数量明显增多，而且这些巨噬细胞的细胞质内都含有铁黄素颗粒。但是由于较小的结构反差，因此在试验中不易识别。而在普鲁氏蓝染色标本中巨噬细胞被染成蓝色识别相较于前者较为容易。需要指出的是肺泡腔内的尘细胞往往以聚集的团状物存在。

2.2.5 肾脏 H.E染色标本中未发现吞噬有铁黄素颗粒的巨噬细胞，在普鲁氏兰染色标本中则可以发现血管球毛细血管之间的球内系膜细胞质内含有铁黄素颗粒。含有铁黄素颗粒的巨噬细胞则主要存在于肾脏的间质内，不过数量稀少。

3 小结

3.1 铁过负荷的病理解剖学诊断 诊断铁中毒主要借助动物的病史和详细的检查：包括动物服用的铁制剂的种类、数量以及时间都、血清铁峰值水平、外周围血白细胞数以及血糖水平。正铁和蛋白质组成的含铁血黄素在病理状态下是一种呈黄褐色的颗粒，在组织细胞内则以黄褐色颗粒或者小块的形式存在，当实施普鲁氏兰试验时，会发生蓝色阳性反应。大量的临床试验证明，只有铁过负荷的动物淋巴结细胞才会含有铁血黄素。本试验用普鲁氏染色液对淋巴结组织块进行染色的方法，只需要15 min就能确切诊断该动物是否铁过负荷。

3.2 铁过负荷的组织病理学诊断 在H.E标本中铁黄素保持其原有的黄色至褐色的颜色变化范围，没有着色。尽管也可以在标本中清晰显示病理变化，但是H.E染色难以与其他黄色色素进行区别，当巨噬细胞中的铁黄素颗粒较少时，铁黄素的色泽往往会被苏木素或者伊红色素掩盖，不能清晰的显示出来。而采用普鲁氏兰染色液染色之后则可以避免该种现象出现，能够通过对其染上蓝色清晰显示出淋巴结、肺脏、肝脏以及肾脏等组织细胞中含有的铁血黄素。

总之普鲁氏兰染色和H.E染色能借助相应细胞变色的原理解释和反映动物铁过负荷的现状。但仅用于定性，不能对动物铁负荷进行定量检测。