Bevacizumab对早期糖尿病大鼠血-视网膜屏障破坏的保护作用

金 燕 刘光耀 (吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 3004)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的严重眼部并发症，血-视网膜屏障(blood-retina barrier，BRB)破坏是DR的主要病理改变之一，是引起糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)的主要原因〔1〕。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是引起视网膜血管渗漏的最主要因子，目前抗VEGF药物正成为DME治疗领域新的研究热点〔2～4〕。本研究在建立糖尿病大鼠模型的基础上，观察抗VEGF单克隆抗体Bevacizumab玻璃体腔注射对早期糖尿病大鼠BRB功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠40只，体重约250 g，随机分为糖尿病模型组(30只)及正常对照组(10只)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)以0.1 mol/L，pH4.2的柠檬酸缓冲液配制成1%的溶液，大鼠禁食12 h后按60 mg/kg腹腔注射STZ，注药后第3天及第7天测尾静脉血糖，血糖≥16.7 mmol/L确认糖尿病模型建立，以后每周测一次血糖、尿糖。正常对照组腹腔注射0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液。建模2 w的糖尿病大鼠用于实验，分为糖尿病组(10只)，药物对照组(10只)，药物干预组(10只)。药物干预组玻璃体腔内注入25 mg/ml的Bevacizumab 3 μl，药物对照组玻璃体腔内注入平衡盐溶液(BSS)3 μl，注药后1 w，采用溴化乙啶(EB)法测定BRB破坏程度。

1.2.2 BRB功能的测定 腹腔注射氯胺酮(90 mg/kg)麻醉大鼠，45 mg/kg EB(Sigma公司)尾静脉注入，2 h后以1%多聚甲醛柠檬酸缓冲液(0.05 mol/L，pH3.5)经心灌注2 min，灌注压力120 mmHg。灌注结束后，立即取出眼球，分离视网膜，快速真空干燥5 h后称干重，加入200 μl甲酰胺(Sigma公司)称其湿重。在70℃下孵育18 h。然后将提取液在4℃，16 000 r/min下高速离心30 min。取上清液100 μl用分光光度计(Beckman，DU-640)测其吸光度(A)值，所用波长为620 nm和740 nm两种，净吸光度值(nA)=A620nm－A740nm。每一样品测量3次，取均值。EB的质量分数根据其在甲酰胺中的标准曲线计算，用视网膜干重(mg)标准化EB(ng)含量，结果表示为ng/mg。

2 结果

正常对照组大鼠视网膜标准化EB质量分数值为(11.39±3.71)ng/mg，糖尿病组为(23.83±3.29)ng/mg，明显高于正常对照组(P＜0.01)。药物干预组大鼠视网膜标准化EB质量分数值为(15.52±2.74)ng/mg，糖尿病药物对照组为(24.15±3.36)ng/mg，两者相比有显著性差异(P＜0.01)。

3 讨论

DME是引起糖尿病患者视力下降的主要原因之一。DME指糖尿病患者出现黄斑部或危及黄斑部的视网膜增厚或硬性渗出，组织学上的黄斑水肿是指黄斑区视网膜内的细胞外液异常积聚，BRB破坏是黄斑水肿的病理基础〔1〕。EB是一种四钠重染料，静脉注射后与血浆白蛋白以10∶1的比例紧密结合〔5〕。当视网膜血管通透性增加时，这种染料-蛋白质复合物就渗漏到周围组织中，用甲酰胺提取组织中的EB，并用视网膜干重标准化所测得的EB质量分数，是目前公认的定量测量BRB的可靠方法。

DME的治疗，包括激光光凝治疗、玻璃体手术治疗以及药物治疗〔1，6〕。近年来，对于传统的激光光凝和玻璃体手术治疗无效的病例，采用玻璃体腔内注射糖皮质激素治疗取得了较好的疗效，但可能导致青光眼和白内障等并发症的发生。研究表明，一部分病人玻璃体腔内注入激素后，视力没有改善。目前抗VEGF药物正成为治疗DME新的研究热点。在DR发生、发展过程中，VEGF是导致视网膜血管渗漏、黄斑水肿及新生血管生成的重要因子〔2〕。Bevacizumab是一种重组的人类单克隆IgG1抗体，通过抑制VEGF的生物学活性而起作用，是世界上首个批准上市的VEGF抑制剂。目前已将Bevacizumab用于治疗老年黄斑变性、视网膜静脉阻塞、DME，均取得了较好的疗效〔3，4〕。本研究结果显示，建模2 w的糖尿病大鼠视网膜标准化EB质量分数值明显高于正常对照组，表明早期糖尿病大鼠出现BRB的破坏。糖尿病大鼠玻璃体腔注入Bevacizumab后1 w，视网膜标准化EB质量分数值明显低于糖尿病药物对照组，提示抗VEGF抗体Bevacizumab对早期糖尿病大鼠BRB破坏有显著的抑制作用，这种抑制作用可能与视网膜VEGF的表达明显下降有关〔7〕，为早期控制DR的发展提供了理论依据。

本研究仅观察了Bevacizumab注射后1 w对早期DR的影响，在此基础上，还需要对药效进行更长时间的观察，以及药物对不同病程糖尿病大鼠视网膜病变的影响，以期对Bevacizumab疗效进行全面评价。

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