影响肉品嫩度的因素及其候选基因的研究进展

李欣蔚，张 勇

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110161）

人类对肉食质量的感知是在咀嚼的过程中，肉食发生复杂物理化学变化，并刺激口腔和鼻腔内感觉神经末梢而产生的。在诸多的主观感觉因素中嫩度是最重要的。嫩度是猪肉品质结构特性的反映。客观评定嫩度通常用肉的剪切力值来表示。

1 骨骼肌结构与肉品品质的关系

1.1 肌纤维直径与肉质

诸多研究表明，肌纤维直径越小，肉质越嫩；肌纤维直径越大，肉质越差。川井田博、曾勇庆、吴德等分别对猪的纤维直径与肉质之间的关系进行了研究，结果表明，纤维直径与肉品的柔嫩度密切相关，且我国地方猪种肌纤维直径比引进猪种的肌纤维直径要细，相应的肉品嫩度较好[1-3]。与此同时，肌纤维直径与肌肉嫩度的关系已被广大学者应用于禽肉嫩度的研究中，经试验证实后得到相同结论。

1.2 肌纤维密度与肉质

有研究证明，随着肌纤维的增粗，肌肉间结缔组织与脂肪含量增加，肌纤维密度下降；骨骼肌肌纤维越细，肌束内肌纤维越密，肉质也越嫩。Ashmore,Suzuki和Johnsfone在所建立的动物肌肉生长模式中指出，动物出生后肌纤维数保持不变。因此，家畜出生后肌肉体积的增加主要是由于已存在肌纤维体积的增大[4-6]。近年来，诸多学者针对肌纤维密度与肉质的关系，以猪、牛等为实验动物进行大量实验。Veiseth-Kent,E等认为肌纤维越细，肌纤维密度大，肌肉脂肪含量高，肉质越嫩[5]。

1.3 结缔组织、脂肪组织的分布与肉质

1.3.1 结缔组织的性质和含量

构成结缔组织的主要成分是胶原纤维蛋白，存在于肌外膜、肌束膜和肌内膜，肌腱中更多，且在酸碱环境中可膨胀；弹性纤维蛋白存在于肌肉血管壁、韧带等；网状蛋白存在于任何组织中，含量少。大量研究证实，肉品嫩度同结缔组织中的胶原纤维和弹性纤维的含量显著相关。Aberle等（1981）发现，牛肉胶原蛋白的溶解性降低时，牛肉的嫩度随之下降[7]。

此外，肌肉中的结缔组织含量、结缔组织中胶原蛋白的种类和交联程度是影响肉嫩度的重要因素。胶原蛋白中最重要的交联反应是赖氨酸分子在赖氨酰氧化酶作用下，氧化脱氨形成醛基，与另一赖氨酸分子的氨基缩合形成醛亚胺键（CH=N-CH2）。这种分子键的交联作用是使胶原蛋白具有必要的韧性和强度。随着动物年龄增长，体内胶原蛋白的总量并不明显增加，但胶原蛋白的交联更加稳定，因而肌肉就更粗糙，嫩度更低。

1.3.2 脂肪的含量和分布

一般认为，肌内脂肪含量对猪肉品质影响较大，尤其是嫩度和多汁性。Herry等（1963）报道，猪肉大理石纹与肉嫩度的相关系数r=0.62。Fernandez等（1999）研究了杜洛克×大白杂种阉公猪腰大肌肌内脂肪对大理石纹评分及肉嫩度的影响，结果表明，随着肌内脂肪含量的增加，大理石纹评分也相应的提高，且显著（P＜0.01）[8]。肌肉中的脂肪组织大部分分布在肌束膜上，肌间脂肪对肌肉的嫩化作用有一种解释：它分割并稀释了结缔组织纤维，使其更适合热处理，热加工时，脂肪细胞破裂，脂肪显著的进行再分布，融化的脂肪会产生令人满意的口感增加肉的美味。Wood等认为，肌肉内脂肪是通过2方面的作用来改善肉的嫩度。一是切断了肌纤维束间的交联结构；二是有利于咀嚼过程中肌纤维的断裂[9]。

1.4 肌纤维类型与肉品嫩度

肌纤维类型可直接通过肌纤维直径或间接通过对肌内脂肪的影响，在一定程度上影响肌肉的嫩度。就肌纤维直径而言，I型纤维直径较细，而2b型纤维直径较粗。因此，在相同屠宰和储藏条件下，肌肉2b型纤维比例增大，会增加肌肉的剪切力，从而降低肉品嫩度。汉普夏猪与瑞典约克夏猪相比，肉质更嫩，就是由于约克夏猪种酵解型肌纤维所占比例较高。

2 钙蛋白酶系统的研究进展与致嫩机理

2.1 钙蛋白酶的结构与生物学特性

广泛存在的钙蛋白酶（calpain）有2种，μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶，两者均由不均一的二聚体蛋白构成，其大、小亚基的分子质量分别为80和30 ku。大亚基具有催化活性，μ-Calpain与m-Calpain的大亚基分别由CAPN1和CAPN2基因编码；小亚基具有调节功能。尽管μ-Calpain和m-Calpain大亚基氨基酸序列有明显差异，但是其高级结构基本相同，都由4个结构域组成，从N端起分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ结构域。在大亚基中，结构域Ⅰ由1～80位氨基酸残基组成，约占全部分子的10%，在蛋白酶激活的情况下很容易发生自溶，由此推测其可能起钙蛋白酶的活性调节作用，μ-Calpain和m-Calpain仅在结构域Ⅰ中不同；结构域Ⅱ含有81～330位氨基酸残基，约占全部分子的35%，是表现钙蛋白酶水解活性的关键部位，在未被激活的条件下含有2个次级区域；结构域Ⅲ由351～560位氨基酸残基组成，约占全部分子的35%，其功能为结合钙离子和磷脂，与蛋白酶调控亚基或其他调控蛋白有关；结构域Ⅳ由561～705位氨基酸残基组成，占全部分子的20%，是结合钙离子的部位，含有4个钙结合蛋白所持有的EF-手型结构。

钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）是细胞内专一抑制Calpain活性的蛋白质。通过抑制Calpain的活性，可抑制肌肉内蛋白质降解，参与肌肉生长过程中蛋白质的更新。Calpastatin蛋白共由5个部分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）组成，其中4个是Calpastatin蛋白的活性中心。当Calpain被钙离子激活后，如果附近有Calpastatin存在，则将迅速与之结合而抑制Calpain活性，从而保证Calpain对底物只进行局部的特定位点的水解。

2.2 钙蛋白酶致嫩机理

μ-Calpain和m-Calpain都能水解肌原纤维。其可能机制是，钙蛋白酶被激活后，首先攻击肌原纤维的肌节（2个相邻Z盘之间的一段肌原纤维）的部位，释放肌丝使降解为小片段，然后被溶酶体所捕获而进一步降解。由于连接蛋白和半肌动蛋白分别以N、C末端和Z盘结合，其多肽链分别从I带延伸到A带，起着使粗丝、细丝和Z盘牢固结合的作用。但近期研究发现，钙蛋白酶首先水解的是N2线，据报道N2线是连接蛋白和半肌动蛋白所在区域，它们分别连接粗肌丝和细肌丝，最终通过I带伸向Z盘。在降解N2线的同时也会降解一些骨架蛋白，使肌纤维释放肌丝。细肌丝的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌丝的C-蛋白降解，分别解离出肌球蛋白和肌动蛋白。释放出的粗肌丝和细肌丝可与母体或其他肌原纤维重新装配，也可以被胞质蛋白酶或溶酶体降解，导致肌原纤维的有序结构被破坏，从而有利于肉的嫩化。但在宰后成熟的过程中m-Calpain的活性几乎不变，而μ-Calpain的活性则显著下降。因此，人们普遍接受μ-Calpain而不是m-Calpain参与了肉的嫩化。并且μ-Calpain的自溶和失活是分子间过程，即使自溶程度很大，它也能完全失活；m-Calpain的自溶是分子内过程，自溶会导致m-Calpain不完全失活。所以，μ-Calpain是蛋白质降解过程中引起肉嫩化的主要酶。

钙蛋白酶抑制蛋白是通过抑制钙蛋白酶的自溶作用而发挥作用的，且这种抑制作用并不受pH的影响。Koohmaraie指出，可用牛肉宰后24 h钙蛋白酶抑制蛋白的浓度来预测最终嫩度。Senky指出猪肉宰后1 h的钙蛋白抑制蛋白浓度与成熟肉的嫩度正相关，相关系数r=0.263,即可用钙蛋白酶水平预测60%的嫩度水平。

3 影响嫩度的候选基因的研究进展

3.1 MyoD基因家族

哺乳动物肌纤维在胚胎形成过程中受到MyoD家族的调控。MyoD家族包括MyoDⅠ、MYOD（myogenin,肌细胞生成素）、myf-5和myf-6。它们编码碱性螺旋—环—螺旋蛋白，通过调节肌肉分化阶段特异性蛋白的表达来参与肌细胞的分化。其中myf-5和MyoDⅠ在肌细胞增殖过程中表达；MyoDⅠ在肌细胞分化末期表达；而myf-6主要在生后表达。Soumillion等利用4种人MyoD cDNA混合片段扫描猪基因组确定了MYOG基因，并发现了3个MspⅠ多态性位点[10]。MYOG可能与出生重、生长速度、胴体瘦肉率有关。Liu等研究发现，p204蛋白对成肌纤维分化是必须的，是通过解除Id蛋白（DNA结合抑制剂）对MyoD和E47蛋白活动的抑制而实现的[11]。

3.2 宰后肌肉蛋白水解因子——组织蛋白酶B

作为一类重要的蛋白酶，组织蛋白酶在生物体内最重要的生理功能就是水解特定的蛋白质，在活体内主要承担水解胞内代谢废物以及异物的功能。Calkins等报道，组织蛋白酶B在牛肉成熟的1～14 d和3～6 d内，对剪切力降低的贡献率分别为35%和58%。另外，组织蛋白酶能将肌肉中的某些蛋白质成分分解成质量不等的肽类和游离氨基酸，进而降解成醛类和酮类化合物，这些成分均是食品肉类、干腌火腿中的风味成分。Russo等提出应该将组织蛋白酶B作为影响猪肉嫩度性状的候选基因加以研究。

组织蛋白酶B具有限制底物进入它们的活性中心的特征。其成熟蛋白结构中有一18个氨基酸长的闭塞环，阻止底物进入位于主要结合区的活性位点，并且提供2个组氨酸His119和His111来结合底物C-末端的带有阴性电荷的羧基团，这可以部分解释组织蛋白酶B比该家族其他成员具有相对较弱的内肽酶活性和其独特的羧肽酶活性。

3.3 肌内脂肪的候选基因

3.3.1 心脏脂肪酸结合蛋白基因

心脏脂肪酸结合蛋白（H-FABP）主要在心肌和骨骼肌中表达。Gerbens等用猪/鼠细胞杂交克隆板的方法将H-FABP定位于6号染色体；他们对纯种杜洛克猪的研究发现3个与肌内脂肪有显著相关的H-FABP多态性位点。他们的研究还表明，肌内脂肪与H-FABP存在显著相关。国内的林万华等对中外10个猪种H-FABP遗传变异进行了研究，发现6个地方猪种均表现为dd型，而外国猪种和培育猪种南昌猪则表现出多态性，这些多态性是否可作为遗传标记还有待于进一步研究。这些研究结果提示H-FABP极有可能是肌内脂肪的候选基因。

3.3.2 脂肪组织脂肪酸结合蛋白基因

Gerbens等分离了脂肪组织脂肪酸结合蛋白（A-FABP）基因，并进行了测序。A-FABP在人、小鼠和大鼠之间高度保守，尤其是所有功能部位的氨基酸序列都是高度保守的。A-FABP被定位于猪4号染色体。Gerbens等对纯种杜洛克猪的研究表明，A-FABP多态性与IMF间存在显著相关。Gerbens等在10个基因型猪群中检测到6个微卫星等位基因，其中A6A9较其他基因型的肌内脂肪含量较高。巧合的是这2个A6A9基因型个体与其MspI PCRRFLP的aa基因型表现相同。他们还研究了H-FABP、A-FABP mRNA和蛋白质表达水平与肌内脂肪含量的关系。结果表明，A-FABP mRNA和蛋白质表达水平与肌内脂肪之间没有显著相关。H-FABP mRNA表达水平与肌内脂肪含量之间没有显著相关。H-FABP mRNA表达水平与肌内脂肪含量差异有关，但在蛋白质表达水平上各基因型间没有显著差异。总之，还不能从其表达水平上解释2种FABP与肌内脂肪遗传变异之间的关系。但他们仍然认为FABP mRNA和蛋白质表达水平与肌内脂肪含量有关。

3.4 钙蛋白酶家族基因

根据钙蛋白酶表现半最高活性所需的Ca2+浓度的不同，可以将普遍存在的钙蛋白酶分为2种：一种为μ-calpain (又称calpain I)，激活所需Ca2+浓度为微摩尔级；另一种为m-calpain (又称calpain II)，激活所需Ca2+浓度为毫摩尔级。已经鉴定了μ-calpain-1两种同工型cDNA的核苷酸序列。猪CAPN1A cDNA开放读码框架约2142 bp，与人和牛的分别有92%和94%的同源性；CAPN1B cDNA开放读码框架约1941 bp，它与CAPN1A cDNA前1941个碱基完全相同。用2点连锁分析法，μ-calpain基因被定位于2号染色体上。

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