新疆紫草繁育生物学及人工栽培

王升，李璇，2，周良云，林淑芳，吴志刚，郭兰萍

（1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031）

新疆紫草繁育生物学及人工栽培

王升1，李璇1，2，周良云1，林淑芳1，吴志刚1，郭兰萍1

（1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031）

新疆紫草是我国重要的药用植物资源，因其临床疗效好、利用价值高，被大量采挖，资源严重破坏。本文从繁育生物学的角度出发，通过异型花柱自交不亲和、果实种子败育率高、种子发芽率低、幼苗移栽定植率低四个方面分析了新疆紫草资源短缺的原因，并提出了人工扩大栽培新疆紫草面临的种源和降低海拔栽培两大困难和解决困难的方法。

新疆紫草；资源短缺；繁育生物学；人工栽培；种苗快速繁殖；降低海拔栽培

紫草（Arnebiae Radix）是我国的常用中药材，味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有凉血、活血、解毒透疹等功效。《本草纲目》曰：紫草 “治斑疹、痘毒，活血凉血、利大肠”。《中华人民共和国2010药典》收录紫草的主要来源为紫草科（Boraginaceae）新疆紫草[Arnebia euchroma（Royle）Johnst.]或内蒙紫草（Arnebia guttataBunge）的干燥根[1]。

新疆紫草[Arnebia euchroma（Royle）Johnst]是传统中药材紫草（Arnebiae Radix）的重要来源。新疆紫草比内蒙紫草的萘醌类有效成分的含量高，临床疗效好，利用价值高[2]。新疆紫草的主要有效成分为紫草素，去氧紫草素，β，β-二甲基丙烯酰紫草素，乙酰紫草素，丙酰紫草素，β-乙酰氧基异戊酰紫草素等萘醌类化合物以及紫草多糖[3，4]。其中的紫草素类萘醌类化合物，具有抑制DNA拓扑异构酶[5]、抗肿瘤[6]、抗 HIV活性、抗血栓、抗生育、抗氧化、镇静、抗炎、促进伤口愈合等药理作用，紫草多糖具有抗病毒活性和免疫调节作用，具有促进机体非特异性免疫和特异性的细胞免疫作用，广泛应用于医药行业[7，8]。另外，紫草素类化合物做为一种天然色素是重要的天然化妆品原料，食品、饮料的天然无毒添加剂，天然印染化工原料等被国际上称为天然红色素之王。正是由于新疆紫草具有非常重要的药用价值和经济价值，近年来被大量采集，加之过度放牧和生态环境破坏等因素的影响，使本来分布狭窄、数量稀少的新疆紫草野生资源受到了严重破坏，导致其野生种类分布区域和数量迅速减少，1996年新疆紫草已经被列为二级保护植物[9]。

为了满足紫草素的市场需求，细胞组织培养的方法已经成为紫草素生产的重要手段。日本早年就建立了硬紫草的细胞培养体系[10]，我国也建立了特有种——新疆紫草[11]和滇紫草[12]的细胞培养体系，并已利用细胞悬浮体系进行工业化生产紫草素，且细胞系中紫草素的含量远高于野生原植物根中的含量。这在一定程度上缓解了非药用紫草素的应用对野生新疆紫草造成的压力。但是，细胞干粉和紫草素仍不能替代中药紫草饮片应用于临床，尤其是新疆紫草在临床上具有独特的疗效，因此新疆紫草仍面临巨大的压力。为满足药用需求，人工栽培迫不及待。但是由于存在野生状态下新疆紫草生境要求严格，结籽率低，种子发芽率低，苗期枯萎，幼苗移栽困难等问题，人工栽培面临着巨大的困难，尚无驯化成功和大面积人工栽培成功报道，只有新疆鹤泊和新疆天牧两家有限公司曾进行过温室栽培和人工样方栽培实验，目前也只是在进行人工种植的中试放大试验。新疆紫草资源短缺，种群范围不断缩小。本文在分析新疆紫草资源短缺的繁育生物学原因的基础上，提出了克服栽培过程中存在的困难的策略[13]。

1 新疆紫草繁育生物学分析

长期以来，国内外对紫草科植物的繁育生物学研究主要集中在植物生殖生物学与进化生物学等方面，例如紫草科植物的不同种属的亲缘关系、同种植物的不同花型、花柱二型性、自交不亲和特性[14]、选择性种子败育[15，16]等方面的研究。而关于新疆紫草则主要集中在繁殖方式、人工种植[17]、长短花柱植株的比例、花的形态特征以及胚胎发育过程等方面。总结新疆紫草资源短缺的繁育生物学原因主要包括异型花柱且自交不亲和、果实种子败育率高、种子发芽率低、幼苗移栽定植率低四个方面。

1.1 异型花柱且自交不亲和

异型花柱（heterostyly）是被子植物中一种特殊的花多态现象和雌雄异位形式，包括二型花柱（distyly）和三型花柱（tristyly）2种类型。异型花柱植物的花部特征在避免自交、促进准确的异交传粉以及通过降低雌雄功能干扰以提高亲本适合度等方面具有重要的进化意义[14]。新疆紫草为镰状聚伞花序，花柱有明显的两型分化现象，为长短二型花柱，种群中有长花柱和短花柱两种表型，两花柱类型在自然居群中的比例为1∶1，两花柱类型强烈的自交不亲和性，属于专性异交的交配方式，相同花型间异交可育，但其结实率（约12%）明显低于型间异交的结实率（约32%），说明不同花型间花粉与柱头的组合比相同花型间花粉与柱头的组合具有更强的亲和性和竞争力[18-20]。

对于自交不亲和的异型花柱类群，导致二型花柱类群结实率和结籽率低的原因可能有多种，其中由于气候或者地理区域不同、传粉者类群变迁导致的花型比例的失衡最为关键[14]。长短两种柱型间居群大小比例的变化，例如居群花型比例严重偏离1∶1，无性克隆繁殖和生境片段化能对于异型花柱植物种群中花型比例失衡产生了直接影响。冯建菊、谭敦炎[21]在新疆紫草二型花柱植株结实特性的比较研究中发现3个样地中长花柱型植株的分枝数、每株花数及结实率均高于短花柱型植株。另外传粉者的变化和减少，也有可能导致自交不亲和的二型花柱类群的结籽率降低，例如当主要传粉昆虫由长喙变为短喙的时候，长花柱型花的花粉就不能被有效地转移到短花柱型花的柱头上，直接导致短花柱花型被选择而大量减少。新疆紫草不同花型间花粉与柱头的组合比相同花型间花粉与柱头的组合具有更强的亲和性和竞争能力[14]。这种现象在药用牛舌草和牛舌草中已有报道，是由于牛舌草属含有多等位基因控制的不亲和系统，该系统与控制花型的位点不连锁造成。新疆紫草表现出的这种自交不亲和的交配方式的控制机制，还有待于进一步研究。新疆紫草究竟是二等位基因控制的不亲和系统还是多等位基因控制的不亲和系统有待研究。如果可以找到控制紫草自交不亲和的基因系统，并加以修饰，从而解决自交不亲和的问题，对于新疆紫草种群的快速恢复是有很大帮助的。

1.2 果实种子败育率高

果实种子败育是指幼果或种子在发育过程中不正常或不充分发育，导致不形成果实、种子或者形成不能萌发的种子。新疆紫草的果实为四分小坚果，但是新疆紫草的结籽率很低，大部分果实都败育或部分败育，一般一个果实仅有一粒种子能成熟，少有两粒（＜50%），罕见3粒，4粒都成熟的情况基本上没有，人工栽培的居群结籽率稍高。野生居群中新疆紫草的结籽率仅10%甚至不到10%[结籽率＝每株结种子数/（每株总花数×4）×100%]。由于新疆紫草在野生条件下形成的种子少，难以收集，所以人工栽培只能挖取野生植株作为栽培的种源，进一步加剧了新疆紫草野生资源的破坏。[19]

植物败育的原因一般有四（1）雄性不育，包括花药退化、花粉败育、绒毡层细胞结构异常等；（2）雌性器官不孕，主要表现为雌性器官形态结构异常、大孢子母细胞及营养器官退化；（3）授粉受精不良，主要表现为自交或异交不亲和；（4）胚中途败育，不同植物胚败育的时间、败育原因及解剖学特征各不相同[22]。新疆紫草的繁育系统的研究中进行了花粉败育率调查和柱头可授性检验。新疆紫草的花粉败育率为20%～30%，其中长花柱花粉的败育率显著大于短花柱花粉的败育率，长花柱花粉小而多，短花柱花粉少而大。新疆紫草在开花一周内柱头都具有可授性，尤其在开花的前3 d具有较强的柱头可授性，另外长花柱柱头的柱头可授性显著高于短花柱柱头，同时观察到未得到亲和花粉的柱头可授性比得到亲和花粉的柱头可授性更强。由此可以推断新疆紫草败育的主要原因可能是授粉或受精不良和胚中途败育[20]。

用开花后套袋法检测，自花后第3 d后依次套袋至花期结束结实率均高于50%，自花开第2 d套袋至花期结束结实率低于50%，但长花柱与短花柱的结实率没有显著差异，第2 d结实率低于50%可能是由于昆虫授粉率较低所致，说明新疆紫草可能存在授粉不良的情况。在新疆紫草花期，中午以后绝大多数是阴雨天，甚至有雪和冰雹，气温急剧下降，此时花朵生长停滞，直至天气转晴，不利天气一方面减少了访花者，另一方面推迟花药的开裂或影响花粉的生活力，使柱头在可授期内不能及时接受到花粉，从而影响了传粉的成功率。地理及气象因素可能还会影响生境昆虫区系，从而影响新疆紫草访花者的种类和数量，昆虫的访花行为、访花频率和传粉效果。但是，新疆紫草单花的开放时间以早晨属多可有效地避免 “洗花”，是新疆紫草在进化过程中形成的对其恶劣生长环境适应的结果。同时，新疆紫草的传粉昆虫多在早晨至中午活动，下午以后以及阴雨天很少有昆虫活动，早晨开花有利于传粉昆虫采集和传递花粉，也是新疆紫草与其传粉昆虫相适应的表现[19，23]。

关于新疆紫草胚发育过程的研究较少，尚不清楚新疆紫草的幼胚在发育过程中是否存在发育障碍，现有的研究推断新疆紫草部分胚败育的原因可能是资源限制和配置问题。在同一花序内，距离花序轴越近，结实率和结籽数≥2的花的百分率越高，而不结籽的花百分率越低，这可能是由于越靠近花序轴的花越具有顶花的资源优势。从植株水平来看，位于低海拔的新疆紫草植株开花时间较高海拔的早，其植株的结实率明显高于高海拔地区，从而形成更多的果实，这可能是因为较早开的花可以获得更多的光、热等资源用于发育果实和种子。从人工栽培和自然居群植株结实格局的比较可见，结两粒种子的花百分率在很大程度上依赖于资源的有效性，在资源贫乏条件下败育的胚珠在较高资源条件下有可能发育成熟，即使是资源较高的地方发育成熟的种子也只有1～2粒，几乎没有成熟4粒种子的花，说明其种子的败育格局可能还是部分受遗传控制[24]。解决这方面的问题应该首先从表面性状上观察胚的发育过程，通过电镜观察，活力测定等方法观察从受精到胚发育成熟过程中是哪个步骤出现了发育障碍。可能存在问题的关键环节有很多，例如花粉管的萌发或延伸，受精过程障碍，原胚形成、球形胚、心形胚、鱼雷形胚或者成熟胚形成过程停止发育，或者胚乳发育不足等等。每个发育过程都有相应的机制，相应的基因控制。对新疆紫草的幼胚的发育过程的观察研究可以将目标锁定在某一个发育阶段，进而深入到某一组调控基因，从根本上阐述和解决种子败育的问题。

1.3 种子发芽率低

新疆紫草的繁殖方式有分根繁殖和种子繁殖两种。由于新疆紫草的药用部位为根，野生新疆紫草资源被掠夺式采挖的同时又鲜有人工种植，所以实际上新疆紫草的繁育几乎仅靠种子繁殖，极少通过分根繁殖。种子繁殖过程中种子发芽率则是繁殖力的瓶颈，结籽率高、发芽率高的植物繁殖力则强。

影响种子发芽率的因素主要包括内部因素，种子的完好性、种子胚的活性等和外部因素，光照、水分、温度、湿度等。新疆紫草种子的发芽率低，内部因素影响很大，即使在最佳温度、湿度、芽床、浸种处理条件下最高发芽率亦只能达到67.33%，但是在野生条件下由于最佳发芽条件得不到控制，种子的萌发率更低，这也是新疆紫草种群得不到恢复的重要原因[25，26]。适时收集种子，控制种子的发芽条件，提高种子的发芽率，确定播种的最佳时期，进行种子种苗的集中生产等可以较好的解决这方面的问题。新疆紫草种子的完好性和种子的胚的活性的研究比较少，研究主要集中在新疆紫草种子发芽的最佳条件的摸索。李晓君等[25]等通过实验发现新疆紫草种子萌发适宜温度为20～30℃，25℃时发芽率最高；清水浸种最佳，最佳浸种时间为24h；50 mg/L的IAA在一定程度上有利于种子萌发；紫草种子发芽率因发芽床而异，砂床较佳，砂间优于砂上。

1.4 幼苗移栽定植率低

幼苗移栽、缓苗到成功定植是新疆紫草种植过程中面临的一个重要的问题，移栽成活率的提高是扩大栽培的前提。由于当地自然气候，社会条件等方面的原因，幼苗的移栽扩大种植存在较大的困难。新疆海拔2 000 m以上的区域植物生长季为4～9月份，气温在5～10℃之间；7～8月是一年中最热地表蒸发量最大的月份，平均气温18℃；8月底至9月初植物停止生长，全年无绝对无霜期。移栽时间段新疆温差大，地表蒸发量大，灌溉不成规模等问题是幼苗定植不成功的主要原因。另外，新疆紫草适宜生长的海拔2 000 m以上的区域，耕地面积小，大多为无人区荒漠，给种植过程中劳动者的操作和田间管理带来较大的困难。

庞克坚等[27]研究不同遮荫对新疆紫草育苗的影响，发现不同强度的遮荫处理对原生苗的叶面积、成活率、地下生长量影响显著。适度遮荫可以增加叶面积和地下生长量，提高幼苗成活率，30%遮荫率的遮荫处理能够同时满足增加生长量和提高成活率的要求，同时避免了叶片先端的日灼伤害。庞克坚等[28]还在移栽试验中发现移栽时间对新疆紫草移栽成活率有极显著影响，实验证明从5月中旬至8月初，定植成活率逐渐下降；8月中旬至9月下旬，定植成活率逐渐升高，并在9月下旬达到峰值。在实验区域，5月初至6月中气温和地温还比较低，蒸发量不大，对新疆紫草的移栽成活率有一定的帮助。6～8月份，温度虽适宜，但地表蒸发量大，晴天的气温较高，常常造成幼苗基生叶的灼伤甚至死亡。进人9月份后，温度逐渐下降，地表蒸发量降低，有利于移栽成活率的提高。早春或秋季移栽可显著提高移栽成活率。苗龄对新疆紫草的移栽成活率影响不大，一年生苗在早春或秋季移栽可以同样达到成活率的要求。依据种植地区的土壤水分条件及蒸发量，适度补给土壤水分可以提高移栽成活率，使土壤相对含水量保持在田间最大持水量的60%～70%，移栽成活率可在80%以上。这些研究都给新疆紫草移栽提供了有力的技术支持。

2 新疆紫草的人工扩大栽培

新疆有很多高海拔的砾石山地，都适宜新疆紫草的生长[29]，充分利用新疆较大面积的、未被利用的高海拔山地优越的光、温等自然条件，人工大面积种植新疆紫草，不仅能够合理而持续地利用自然资源，还能取得环境改善与经济效益的同步发展。

新疆紫草具有野生自然资源极度匮乏、种子繁殖率低、适应生长区海拔较高等特点，在人工扩大栽培过程中，种苗的快速高效获得和高海拔适生区向低海拔生长区的适应性驯化是实现新疆紫草的GAP生产，制定种植标准操作规程SOP两大瓶颈问题。

2.1 种苗的快速繁殖

目前在解决药用植物种苗繁殖问题的主要方式有二，其一是集中采种育苗，其二是利用无性快繁的方式获得大量的组培苗。

新疆多种药用植物的种植都是采用采种育苗的方式进行种苗的培育后移栽，目前技术比较成熟的有红花、甘草、红景天、雪莲等。采种育苗的方式主要适应于容易获得种子的植物的种苗批量繁殖。近年新疆紫草被掠夺式地挖掘，资源日渐枯竭，加之新疆紫草种子繁殖缓慢，生长五年才开花、结果，获得大量种子十分困难。对于新疆紫草而言种子的来源、种子发芽率、出苗率和幼苗成活率都是采种育苗过程中需解决的难题。庞克坚、王晓东、王玉春[30]应用种子包衣技术提高了新疆紫草育苗的成活率，研究发现新疆紫草种子经包衣处理后能够显著提高育苗的成活率有效促进幼苗的生长发育，经以非豆科牧草种衣剂包衣处理后种子的出苗率、保苗率和当年的生长量分别提高14.25%，46.31%和42.02%，在一定程度上解决了新疆紫草育苗的困难。另外，育种过程中注意长短花柱类型新疆紫草的比例，可以提高育种的效率。

组织培养无性快繁技术能够在短时间内获得大量的栽培苗，缩短育种周期，解决新疆紫草的种源问题。我国已有通过现代生物技术进行种苗的快速繁殖解决濒危药用植物种源的案例，如石斛。石斛是我国珍稀濒危的药用植物之一，也曾经面临过度采挖濒临灭绝的境地。石斛具有生态适应性差、生境独特，种子极其微小，胚具有后熟现象，自然条件下种子难以萌发（一般萌发率低于5%），无性繁殖成活率低、速度慢等生物学特征[31]。近年来，在大批学者的共同努力下，利用无性快繁技术实现了组培种苗的批量化生产，解决了石斛的繁育问题，逐步实现了石斛的大规模人工种植[32]。目前利用无性快速繁殖解决种子种苗的稀缺问题，研究较多的药用植物还有番红花、地黄、盾叶薯蓣、半夏、百合等。因此，实现新疆紫草的大面积种植，建立新疆紫草无性快繁体系，解决新疆紫草种苗问题就显得必要而具有现实意义[33]。新疆大学生命科学与技术学院的计巧玲[34-36]等建立起了新疆紫草无性繁殖系，通过诱导新疆紫草的愈伤组织生成不定芽和诱导细胞悬浮系生成胚状体发展成为幼苗两种方式，建立起来的新疆紫草的无性繁殖系稳定可用。新疆紫草的无性快繁虽然已经取得阶段性的成功，但是快速繁殖的效率还不能达到规模化的水平，要在新疆紫草生产实际中实现无性快繁还需要进一步的努力。另外，对于组织培养获得新疆紫草实生苗，还需要解决提高试管苗复壮移栽成活率的问题才能运用到生产实践中。

2.2 降低海拔栽培

高海拔地区植物生长的环境气温、土温都较低，光照强度大且紫外线强，氧气稀薄，生育期相对较短。由于高海拔地区大规模种植作物人工管理困难，所以常常需要将高海拔植物引种驯化到相对低海拔种植。从高海拔向低海拔地区引种，气温由低到高，紫外线由强到弱，光照强度降低，生育期相应延长。目前，雪莲、红景天、川贝母等高海拔药用植物从高海拔向低海拔地区的引种已经获得成功[37-39]。降低海拔栽培的首要问题是种子或幼苗的处理，并采取措施缩小引种地和原产地之间的环境条件的差异。

高海拔地区生长的植物在自然状态下冬天需经历一个时间相对较长的低温，经过长时间低温覆盖的种子在来年开春后萌发成健康的实生苗。降低海拔栽培后的自然低温不能满足种子生理后熟的需要，容易导致实生苗夭折。马晓匡[39]在川贝母降低海拔的栽培研究中采用了满胚种子（1～2℃，60 d）低温处理，模拟高海拔地区冬季的自然低温完成种子的形态和生理后熟，能够提高种子的发芽率和实生苗的成活率。新疆紫草在育苗过程中也可以借鉴这种处理方式提高低海拔栽培育苗的成活率。

降低海拔栽培过程中，针对高、低海拔地区气候不同，可以采取以下措施缩小引种地和原产地之间的环境差异，如遮阴、适时灌水、高畦、畦面覆盖等措施，降低低温，保持土壤湿润，增加散热，保水、减少地表蒸发[38，39]。

另外，为了克服新疆紫草由高海拔地区到低海拔地区人工种植不易成活的困难，可以选择性从海拔最低的适生地将新疆紫草向低海拔的种植区引种，以提高引种的成功率。亦可以采用逐步迁徙或进行多代的定向连续培育，在实生苗中选择适应性最强的植株的种子，再播种、培育、选择，不断积累，加强对引种地环境的适应性。

针对新疆紫草进行试管苗无性快繁的情况，可以进行 “试管苗驯化”[40]，即引种驯化工作不在自然状态下进行，而在可以人工控制的试管中开展。“试管苗驯化”是既能够实现新疆紫草的定向培育，又能够缩短育种周期，是适合引种驯化新疆紫草组培实生苗的一种方式。

3 结语

目前，已知了新疆紫草致危的主要繁育生物学原因，但是新疆紫草二型花的形态发生、开花及传粉生物学特点、结实格局、种子败育水平与方式、种子萌发特点等与致危原因之间的关系相关理论方面还有待于进一步深入研究。新疆紫草的野生资源呈逐年锐减的趋势，除了上文分析的繁育生物学方面的原因之外，更重要的是人们对新疆紫草自然资源的过度利用、新疆生态环境的变化如草甸区荒漠化、气候干旱等。为了保护这一珍稀药用植物资源，开展迁地保护和人工种植迫在眉睫。从事新疆紫草保护和开发的工作者们，目前工作的重点应该是探究和解决新疆紫草种植过程中面临的问题，制定出合理的种植标准操作规程SOP，实现新疆紫草的GAP规范化种植，生产出优质道地中药材，以满足社会需求，保护日益濒危的野生资源，维持产区的生态平衡，实现经济效益、社会效益和生态效益的共赢。

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国家自然科学基金（81130070，81072989），国家中医药管理局行业科研专项（201107009），国家科技重大专项（2009ZX09502-026，2009ZX09301-005）；中国中医科学院课题ZZ20090302.发改办高技 【2010】1196.

*郭兰萍，Tel：（010）64011944，E-mail：glp01＠126.com

2011-10-31）