病原菌TAL效应子与寄主靶基因相互识别的分子密码

李岩强，王春连，赵开军

中国农业科学院作物科学研究所 农业部作物遗传育种重点实验室 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，北京 100081

黄单胞杆菌属 (Xanthomonas) 的多个致病变种，在多种作物上造成严重的病害，包括辣椒和番茄的细菌性斑点病、水稻的白叶枯病和细菌性条斑病[1]。TAL 效应子 (Transcription activator Like effector) 作为黄单胞杆菌的蛋白类效应子之一，能够通过三型分泌系统 (Type III secretion system，TTSS) 进入植物的细胞核，并与特定基因启动子DNA结合，类似于真核生物转录因子，启动植物基因的表达，以控制植物的生理生化进程。病原菌通过进化产生一系列的TAL效应子以利于在寄主上的定殖和传播，而植物亦进化出一系列的抗病策略以抑制该病原菌引起的病害。因此针对不同的寄主植物的基因型，TAL效应子既有可能是毒性因子，也有可能是无毒因子。近年来关于黄单胞杆菌的蛋白类效应子TAL效应子的研究有许多新进展，尤其是TAL效应子与寄主 DNA特异性识别的分子密码的破解，将在生物工程领域和植物抗病育种应用上产生重要的影响。本文在介绍TAL效应子类蛋白的发现及功能、TAL效应子与寄主靶基因识别的专一性及其分子密码的基础上，讨论了该分子密码的应用前景。

1 TAL效应子的发现及研究现状

1.1 TAL效应子的发现及功能

第一个TAL效应子 (AvrBs3) 于1989年发现于辣椒斑点病细菌 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (xcv) 中，其编码基因avrBs3的中心区有17.5个几乎相同的102 bp碱基重复，每个重复编码34个氨基酸，全基因共编码一个1 164 aa的蛋白质(122 kDa)[2]。此后发现的TAL效应子类蛋白被称为AvrBs3家族蛋白。TAL效应子类家族蛋白具有结构的相似性 (图1A，B)：1) N端高度保守，其mRNA水平上存在着TTSS分泌信号 (T3S)；2) C端含有亮氨酸拉链结构 (Leucine zipper，LZ)、核定位信号(Nuclear localization signals，NLSs) 和酸性转录激活域 (Acidic activation domain，AD)；3) 中间为多个串联重复单元组成的串联重复区，每个重复单元含有34个氨基酸，其中第12和13位氨基酸高度可变，被称为重复可变区 (Repeat-variable diresidue，RVD)[3]。研究表明NLS具有核定位功能，而保守的LZ和 AD结构都是引起过敏反应 (Hypersensitive reaction，HR) 所必需的。所有的 TAL效应子都具有相同的NLS及AD，只是其重复可变区的重复数目和重复类型不同，并决定TAL效应子与寄主识别的特异性。

TAL效应子对于寄主植物，既是无毒因子，又是毒性因子。从最早克隆的avrBs3基因到最近克隆的avrXa7、avrXa10、AvrXa27，分别能使含相应抗病基因的寄主引起 HR反应，从而引起寄主的抗病反应，表现出无毒效应子功能。而对于不含相应抗病基因的寄主，这些无毒蛋白就表现为毒性因子，能够引起寄主植物发病。

1.2 已经克隆的TAL效应子编码基因及其寄主靶基因

TAL效应子类蛋白广泛存在于黄单胞杆菌属Xanthomonas和少数的青枯拉尔氏菌属 Ralstonia solanacearum中[4]。水稻黄单胞杆菌白叶枯病致病变种 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 引起的水稻白叶枯病 (Bacterial blight，BB) 是一种典型的“基因对基因”病害，植物病原细菌的无毒基因 (Avirulence gene，avr) 和寄主植物抗病基因 (Resistance gene，R) 的显性互作决定不亲和反应[5]。李平等 2004年对黄单胞菌无毒基因的研究进展作了综述[6]。李玉蓉等于2007年对水稻黄单胞杆菌白叶枯病无毒新基因的克隆以及细菌性条斑病 (Bacterial leaf streak，BLS) 的病原菌 (Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)无毒基因的研究进展进行了综述[7]。但随着黄单胞杆菌属许多生理小种的测序[8-12]与进一步研究，该领域的进展日新月异。目前，已有更多的TAL效应子编码基因及其寄主靶基因被克隆。例如，我们通过构建PXO99的Tn5转座子插入的突变体库，筛选使近等基因系 CBB23致病的菌株[13]，并克隆了水稻 Xa23基因对应的无毒基因 avrXa23，发现AvrXa23蛋白是一个TAL效应子，它被Xa23基因的启动子陷阱捕获而激发水稻产生强烈的抗病反应。White等于2009年将已鉴定的TAL效应子及其寄主靶基因的信息进行了列表综述[14]，由于该领域进展很快，笔者在 White文章基础上将国内外已克隆鉴定的黄单胞菌TAL效应子及其相关信息的最新进展整理成表1。

图1 以AvrBs3为例说明TAL效应子的结构和功能Fig. 1 Structure and function of the TAL effector AvrBs3. (A) The TAL effector AvrBs3 contains central tandem repeats (Repeat domain), the type III signal at N-terminal in mRNA level; the nuclear localization signals (NLSs) and an acidic transcriptional activation domain (AD) at C-terminal. (B) The amino acid sequences of the repeat domain of AvrBs3. The amino acids 12 and 13 are hypervariable, the repeats are numbered in the right and the left is the corresponding nucleotide. Because the all known UPT box has an invariable 5' T, so the 0-position is the nucleotide T. (C) Using the nuclear localization signals, the TAL effectors translocate into the plant cell through type III secretion system, bind the UPT Box of target genes: the R genes or S genes, respectively result in the resistance such as HR response and disease symptom like hypertrophy.

绝大多数的TAL效应子对应的寄主靶基因仍然未知，研究最清楚的avrBs3，其寄主靶基因为Bs3、UPA20等；AvrBs3被注入到植物的细胞核中，其中抗病基因 Bs3启动子区存在能够特异性识别该无毒基因的元件，受其诱导表达，产生抗性[15]。感病品种中受AvrBs3诱导的UPA20等是感病相关的基因，UPA20是一个转录因子，能够诱导下游基因 UPA7的表达，进而引起寄主细胞肥大，有利于病原菌的侵染和定殖[16]。AvrBs4的寄主靶基因是Bs4，与其他TAL效应子不同的是，AvrBs4是在植物细胞质而不是细胞核中与Bs4识别并产生抗病的[17]。其他研究比较明确的主要为水稻白叶枯病细菌的 TAL效应子及其对应的寄主靶基因，如 avrXa3/Xa3、avrXa5/Xa5、avrXa7/Xa7和Os11N3、avrXa10/Xa10、

avrXa23/Xa23、avrXa27/Xa27、pthXo1/Os8N3、pthXo3/Os11N3、pthXo6/OsTFX1、Tal9a/OsHEN1等(表1)。抗白叶枯病基因Xa27能够专一性地受含无毒蛋白 avrXa27菌的诱导，引起植物的抗病，而其等位基因xa27由于启动子区的缺失和突变，不能受avrXa27的诱导，进而发生感病[18]。PthXo1是一个毒性因子，它能够诱导水稻中感病基因Os8N3的表达，引起植物感病，对该感病基因进行沉默可以使水稻对含PthXo1的菌株产生抗性，Os8N3是MtN3家族中的一员，对水稻的花粉发育有促进作用，但是Os8N3的生化功能还未知[19]。而隐性抗白叶枯病基因xa13是Os8N3基因启动子区发生了变化而不能够受PthXo1的诱导表达[20]。目前鉴定的TAL效应子类蛋白绝大多数为毒性因子，少数的为无毒因子，而目前发现的大部分寄主靶基因为抗病基因，也有少数的为感病基因如：Os11N3、Os8N3、OsTFX1及OsHEN1等。当前研究比较清楚的TAL效应子都与靶基因启动子识别进而引起抗病或感病反应，而仍然有许多 TAL效应子与靶基因的作用机制仍不明朗，需要进一步的研究证实。

表1 已鉴定的TAL效应子Table 1 List of identified TAL effectors

2 TAL效应子与寄主靶基因识别的专一性

含有AvrBs3蛋白的黄单胞杆菌能够引起含Bs3基因的辣椒品种ECW-30R的抗病反应，即产生HR (图1C)，对avrBs3的重复区进行缺失突变后，发现缺失突变体avrBs3∆rep不能引起ECW-30R产生抗病反应[2]。但其中的一些突变体如avrBs3∆rep16 (缺失 11~14之间的重复) 能够引起另一个辣椒品种ECW产生HR反应。后来的研究发现AvrBs3∆rep16能够特异性识别Bs3等位基因Bs3-E的启动子[15]。AvrXa7和AvrXa10分别含有25.5和15.5个重复单元，若它们的重复区互置，所识别的抗病基因 Xa7和 Xa10也发生相应的变化，即含有 AvrXa10重复区的AvrXa7可以识别Xa10，含有AvrXa7重复区的AvrXa10可以识别 Xa7[21]。水稻抗白叶枯病基因Xa27专一性地受白叶枯病原菌中无毒蛋白AvrXa27的诱导表达[18]，感病基因Os8N3 (Xa13) 受TAL效应子PthXo1的诱导[19]，而当Os8N3启动子区发生突变，可以逃避 PthXo1的识别，xa13抗病基因便因此获得对白叶枯病的抗性[20]。

深入的研究发现，TAL效应子与寄主靶基因的特异性识别发生在启动子区域。AvrBs3和AvrBs3∆rep16分别特异地与Bs3及Bs3-E的启动子区的特定序列互作[22-23]，Römer等将这些识别序列称为UPT((UP regulated by TAL effectors)Box。缺失突变分析和体外的 EMSA实验表明：AvrBs3和AvrBs3∆rep16分别与UPTAvrBs3box和UPTAvrBs3∆rep16box专一性识别[22]。水稻抗白叶枯病基因Xa27受无毒蛋白AvrXa27的诱导表达，序列分析发现，Xa27与其等位基因xa27的编码区没有明显的差异，只是在启动子区存在碱基的缺失和变异[18]。对Xa27的启动子进行分析，并将靠近TATA box区的突变位点的相关片段导入到 xa27的启动子中，发现融合后的xa27启动子能够受 AvrXa27的诱导，利用缺失突变及 EMSA实验最终确定了最短的 UPTavrXa27box序列[23]。TAL效应子不仅能够识别抗病基因的启动子，它们的靶基因还可能是感病相关的基因。受AvrBs3诱导的Upa20基因能够引起植物生理状态上的变化，例如细胞分裂以及细胞增大，以利于病原菌在寄主中的定殖和生长 (图2C)[16]。受无毒因子诱导的另外一些典型的感病基因如 Os8N3 (Xa13)、OsTFX1以及Os11N3等分别受PthXo1、PthXo6及AvrXa7的特异性诱导[19,24-26]。同样地，利用缺失突变及 EMSA实验分析的方法，相应的 UPT Box：UPTPthXo1Box、UPTPthXo6Box以及UPTAvrXa7Box得到确认，根据UPT box单个碱基的突变分析表明，特定的TAL效应子，专一性诱导特定的UPT Box[27]。上述实验表明，特定的TAL效应子识别相应的UPT box，这也是为什么许多R基因 (Bs3、Xa27、Xa7、Xa10) 仅受特定的AvrBs3类无毒蛋白诱导的原因，这从分子水平上验证了“基因对基因”学说。

3 TAL效应子与寄主靶基因识别的分子密码

AvrBs3直接识别被其诱导的靶基因启动子区的UPT Box[22,28]，引起受AvrBs3诱导的许多基因如UPA1-11[29]、UPA14-25[30]的表达，导致感病植株的叶肉细胞肥大 (图 1C)。Kay等分析受 AvrBs3诱导的基因Bs3、UPA10、UPA12、UPA14、UPA19、UPA20、UPA21、UPA23及UPA25启动子转录起始点上游100 bp序列，发现这些受AvrBs3诱导的基因含有相同的UPA motif基序，有19个核苷酸组成的box具有极强的保守性，与以前鉴定的AvrBs3的UPT Box一致[30]。由于UPT Box[18 bp[29]和19 bp[30]]的碱基数与 AvrBs3的重复数 (17.5) 基本一致，Boch等推测 AvrBs3的每一个重复单元识别一个特异的DNA碱基对[31]。当每一个AvrBs3的重复类型(每个重复区的第 12和第 13氨基酸) 对应到 UPT Box中去时，发现特定的重复类型与目标DNA上的特异碱基相关联 (图1B)。例如HD和NI分别对C和A有很强的偏爱，而AvrBs3∆rep16 (缺失11~14之间的重复)，能够识别更短的或者 (DNA Box的3′端)不同的目标DNA序列[31]。另外，在UPT Box的5′末端，对应于第一个预测的重复碱基的前一个位点上含有一个保守的 T[31]。后来的研究发现保守的 T碱基对于诱导活性至关重要[27]。Boch等通过分析多个无毒蛋白重复类型以及受其诱导的基因启动子区的UPT Box的对应关系，构建了不同重复类型特异性识别目标DNA碱基的分子密码模型[31]。与此同时，Moscou和 Bogdanove利用计算机扫描比对TAL效应子中可变重复类型与目标启动子中的DNA序列，统计分析得到了类似的分子密码模型(图1B)[32]。

为了验证病原菌无毒蛋白与靶基因 DNA特异性识别的分子密码模型，Boch等分析受AvrXa27、PthXo1、PthXo6及 PthXo7诱导的基因及其等位基因的启动子区，发现受诱导的基因中均含有相匹配的UPT Box，而不受诱导的等位基因找不到相应的UPT Box[31]。他们将预测的 UPT Box构建到最小Bs4(–55~+25) 启动子的上游，驱动 GUS基因，与含有相对应35S启动子驱动的TAL效应子载体的农杆菌共注射本茗烟，证明预测的UPT Box受相应的TAL效应子诱导。他们还根据已知的密码模型，成功预测了Hax2的靶基因PAP1(At1G56650)。此外，Boch等构建了7个人造的TAL效应子 (ArtX)，将它们构建成N端融合了GFP报告基因的人造效应子，并检验其诱导含有预测的UPT box的Bs4启动子驱动报告基因表达的能力。这 7个人造效应子都只激发含相应的UPT Box的启动子引起GUS表达活性，且人造的ArtX和GFP融合蛋白能够在植物细胞中表达[31]。

4 TAL效应子与寄主靶基因识别密码的应用前景

4.1 TALN的产生及应用前景

TAL效应子与寄主靶基因的互作是一种新型的蛋白-DNA结合方式，即2个特异的氨基酸组合对应1个特异的碱基。根据TAL效应子与寄主靶基因相互识别的分子密码，科学家已将TAL效应子与核酸内切酶 FokⅠ融合构建了新型的位点特异性识别的工具酶TALNs (TAL effector nucleases)，并通过体外实验，对识别的特异性进行了验证[33-34]。Li等构建了AvrXa7和PthXo1与核酸内切酶FokⅠ融合的酶，通过体外的 DNA酶切实验以及酵母内的重组实验均证明，TALN能够特异性地识别其目标DNA序列，并使 FokⅠ在特定的位点进行酶切[33]。Christian等先是利用AvrBs3及PthXo1和核酸内切酶FokⅠ融合的酶，发现了不同的融合酶对于酶切位点的活性受识别位点的距离的影响，他们还证明使用 2个不同的融合酶能够分别识别特异的位点并共同完成酶切。同时，为了验证该分子密码，他们找到了基因组上的序列，并按照频率最大的密码 (NI对应A， HD对应C，NN对应G以及NG对应T) 人工设计了相对应的TAL效应子，通过酵母内的实验发现许多人工设计的融合酶具有很强的活性 (图2A)[34]。

这些实验证明了利用分子密码设计相应的TALN完成真核生物基因组的重组和突变成为可能。例如可以设计能与特定 DNA序列结合的人造效应子，以完成靶基因的定点突变和重组。另外，这种转录因子模式可以控制目的基因转录水平上的表达，如利用特异识别启动子的人造TAL效应子作为基因表达的分子开关，在转录水平上进行基因的表达调控。当然，这种机制不仅仅用于植物，也可能应用于人类重要疾病比如癌症等的基因治疗。我们预计，TALN将在未来的基因治疗中受到重视并发挥重要作用。

4.2 利用分子密码发掘更多的抗病基因和感病基因

根据分子识别密码，可以利用TAL效应子的可变区序列预测并寻找抗病基因或感病基因 (图2B)。比如水稻基因组序列已经完成，可以利用TAL效应子可变区序列，扫描基因组序列，找到受其诱导的启动子，进而研究相应基因的功能。这可能为寻找抗病基因开辟一条新的途径。如 Boch等根据 TAL效应子HAX2的序列，推测出其对应启动子的序列，并在拟南芥基因组中找到了靶基因 MYB转录因子类的PAP1 (At1G56650)[31]。现在已发现多个毒性因子TAL效应子，这样可以根据其可变区 (RVD) 的变化，推测出与感病相关的基因，研究植物感病的分子机制，并利用 RNAi的办法抑制感病基因从而达到提高抗病性的目的。

图2 TAL effector与靶基因识别的分子密码的应用前景Fig. 2 Applications and future prospects of molecular recognition code between TAL effectors and host genes. (A) Construction of hybrid TAL nucleases (TALN). This chimeric protein can bind the target nucleotides and cut at the relative position using the Fok I digestion function. This diagram takes the AvrXa7 and PthXo1 used in Li's paper[33] as an example. (B) Identify the resistance related genes. The known effectors can be used to identify their target genes through pattern search in the host plant's information resource. In this way, more and more resistance or susceptible genes can be identified in the future. (C) Create broader spectrum resistance gene. Multiple UPT-Boxes can be combined in one promoter to drive a R gene like Rxo1 or Xa27. This new engineered R gene complex can be recognized and induced by different TAL effectors, resulted in resistance to more pathogenic bacteriums.

4.3 利用分子密码开发广谱抗病基因启动子

Römer等利用基因工程的方法将不同的 UPT Box聚合到一个启动子上，获得受多个TAL效应子诱导的新启动子[27]。这种新型的启动子使利用基因工程扩展抗病基因的抗谱成为可能。例如，在水稻白叶枯病抗病育种中，选育和种植抗病品种是防治该病的最经济、有效和环保的途径。目前国内外报道的白叶枯病抗病基因已经有 36个之多[35]，但是由于水稻白叶枯病原菌致病性的变异和新毒性菌群的不断出现，一些抗病品种的抗性逐渐丧失[36]。根据“基因对基因”理论，抗病基因是和相应的无毒基因互作后起作用的，介导的抗性是小种特异性的，向植物中导人某一抗病基因后，它可以对携带特定无毒基因的病原菌产生抗性。目前克隆得到的抗白叶枯病基因的无毒基因很多，可以根据分子密码设计受多种无毒基因诱导的UPT Box[27]。将新设计的含多个UPT Box的启动子驱动一个抗病基因，使该抗病基因受多个无毒基因产物的诱导，进而扩大抗病基因的抗谱 (图2C)。另外，目前在细菌性条斑病细菌 (Xooc) 中也克隆到一些TAL效应子类基因[37]。但是抗细菌性条斑病的主效基因报道仍然很少[38]，目前比较有效的为非寄主抗性基因Rxo1[39]，而组成型表达的抗白叶枯病基因 Xa27也可以抗一些细菌性条斑病小种[40]。可以利用TAL效应子与寄主靶基因 DNA识别的分子密码设计受多个细菌性条斑病细菌TAL效应子诱导的启动子，驱动抗病基因如Rxo1或Xa27，进而得到抗细菌性条斑病的抗病基因。目前我们拟利用已经克隆得到的 avrXa23以及已经发表的无毒基因，根据分子密码推测的UPT Box组合成一个受多个TAL效应子诱导的抗病基因启动子，用于驱动抗病基因，期望能够获得更大的抗谱。

4.4 问题及展望

TAL效应子与其靶基因互作的研究取得了很大进展，但是仍然有许多问题需要进一步揭示。例如TAL效应子到底如何与 DNA碱基相结合，包括结合的方式及分子机制，以及为什么发生特异性的结合，这些都需要完成TAL效应子及TAL-DNA复合物的晶体结构解析才能准确地回答。TAL效应子与寄主靶基因相互识别密码的广泛性还需要新的实验证明。对于分子密码的应用研究也只是刚刚开始，TALN在基因组靶向修饰中的使用条件以及在各个物种中的通用性仍然需要进一步研究。受多种 TAL效应子诱导的启动子已经构建成功，但是构建的新型启动子能否获得更大的抗谱仍然需要实践证明。尽管如此，TAL效应子与寄主靶基因识别的分子密码作为一种新型的识别机制，具有很强的专一性，利用该分子密码设计新的基因工程酶，寻找更多的抗病基因，构建更多抗谱的抗病基因将会有巨大的应用前景。继续研究黄单胞杆菌TAL效应子与其对应的寄主靶基因相互识别的分子机制，并将其相互识别的分子密码应用于生物医学工程及农业抗病育种技术中去，将为人类战胜疾病及获得更多的粮食提供更大的支持。

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