重度子痫前期患者血清对外周血NK细胞杀伤活性的影响

魏军，杨志英，杨在霞，刘彩霞

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

重度子痫前期患者血清对外周血NK细胞杀伤活性的影响

魏军，杨志英，杨在霞，刘彩霞

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

目的研究重度子痫前期患者血清对NK细胞杀伤活性影响。方法 重度子痫前期患者组（病例组）、正常妊娠妇女组（对照组）各15例，采用1∶1配比的病历对照研究。采用Percoll不连续密度梯度方法分离健康非孕妇女NK细胞，用10%、20%、40%浓度重度子痫前期患者血清及20%正常妊娠妇女血清孵育NK细胞20h，。采用MTT法检测不同血清对NK细胞杀伤活性影响。结果 在用20%重度子痫前期患者血清及正常妊娠血清孵育20h后，重度子痫前期组NK细胞杀伤活性为（48.68±8.47）%，正常妊娠组为（35.21±8.24）%。与正常妊娠组相比，重度子痫前期组NK细胞杀伤活性增强，差异有统计学意义（P<0.01）。在重度子痫前期组，用10%浓度血清孵育20h后，NK细胞杀伤活性为（39.98±7.65）%，40%浓度血清组为（58.33±7.45）%，重度子痫前期组中10%、20%、40%浓度血清组间两两相比，差异有统计学意义（F=24.326，P<0.01）。结论子痫前期患者血清中某些因子可使NK细胞杀伤活性增强。

子痫前期；NK细胞；杀伤活性

子痫前期是导致孕产妇和围产儿死亡的重要原因之一，其病因及发病机制始终是产科研究热点。目前研究认为，子痫前期是由于胎盘浅着床，滋养细胞及蜕膜淋巴细胞分泌细胞毒性因子入血，直接或间接损伤血管内皮细胞，进而引起子痫前期发病［1］。

NK细胞是一种大颗粒淋巴细胞，占外周血淋巴细胞10%。近年研究发现，NK细胞是调控胎盘生长分化，诱导母体对被视为“半同种异体移植物”的胎儿产生免疫耐受的关键调节细胞之一［2］。我们在既往研究中发现，在重度子痫前期血清作用下，NK细胞通过LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1黏附通路，与血管内皮细胞黏附增强，提示子痫前期血清可活化NK细胞，进而参与子痫前期发病［3］。为进一步探讨重度子痫前期患者血清对NK细胞其他功能影响，本研究采用MTT方法，检测子痫前期重度患者血清对NK细胞杀伤活性影响。

1 材料与方法

1．1 研究对象

选择2006年1月至2008年1月中国医科大学附属盛京院产科门诊及住院患者。采用1∶1配比的病历对照研究。病例组：重度子痫前期患者15例，诊断标准参照第七版《妇产科学》［4］。年龄（30.67±3.83）岁，孕周（33.67±2.31）。对照组：与病例组年龄、孕周完全匹配的正常妊娠妇女15例，年龄（30.60±3.04）岁，孕周（32.87±2.42）。入选病历无糖尿病、风湿免疫系统疾病等合并症。

1．2 试剂和仪器

MTT购自Biomol公司，二甲基亚砜购自Amresco公司，Percoll分离液购自天津TBD生物技术有限公司。酶标仪（MK3型）为Labsystem Dragon公司产品。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：空腹抽取重度子痫前期患者及正常孕妇肘正中静脉血4ml，室温静置20min，3500r/min离心3min，血清分装于无菌管中，-70℃冰箱保存。

1.3.2 外周血NK细胞分离：（1）外周血单个核细胞分离：采健康非孕妇女肘正中静脉血50ml，注入肝素抗凝无菌管中。加入等量PBS稀释、吹打、混匀。离心管加淋巴细胞分层液，将稀释血缓慢注入淋巴细胞分离液层面上。注意勿使血液混入分层液内。在（18～20）℃下，以2500r/min离心30min。收取单个核细胞层，PBS洗涤3次。将获得的单个核细胞悬浮于PBS中；（2）Percoll不连续密度梯度分离NK细胞：计数外周血单个核细胞悬液的细胞浓度。用完全培养基将细胞配成107/ml浓度，倾倒于玻璃平皿，在37℃，5%CO2条件下孵育60min，每15～20min振摇1次，吸出的未黏附细胞为纯化淋巴细胞悬液。用PBS按2.5%浓度递减，从50%开始将percoll稀释成6个浓度，每个浓度1ml，逐层叠入10ml离心管。将纯化淋巴细胞悬液小心加入percoll分离液上层，2500r/min水平离心20min。收集42.5%和45.0%2层Percoll液，再次离心，PBS洗3次以去除Percoll介质，细胞重悬于完全培养基。CD56单抗间接免疫荧光发鉴定纯度，台盼蓝拒染法测存活率。NK细胞纯度70%，活性在95%以上。细胞计数，调制NK细胞浓度6×105/ml。

1.3.3 靶细胞制备：K562是人类红白血病细胞系，由中国医科大学实验技术中心二部惠赠。在含有10%胎牛血清，青、链霉素各100U/ml的RPMI 1640，37℃，5%CO2温育箱中培养 24h。 用完全RPMI-1640培养液洗涤 1次，1000r/min离心 6min。用完全RPMI-1640培养液重悬，调细胞数为1×105/ml。取96孔细胞培养板，每孔加K562细胞悬液100μl，每孔细胞数为 1×104。

1.3.4 在20%标本血清作用下，NK细胞杀伤活性比较：取100μl NK细胞至细胞培养管中，每管6×104个NK。分别加重度子痫前期及正常妊娠血清40μl，每管加 RPMI-1640培养液至终体积 200μl，血清浓度为20%，培养20h后用PBS洗涤3次。

在K562细胞培养孔中（1×104）加效应细胞2×104个 NK，效靶比为 2∶1。最终每孔体积 200μl。每个标本作3个复孔。效靶细胞孵育4h。

1.3.5 不同浓度重度子痫前期患者血清对NK细胞杀伤活性影响：为了比较不同浓度重度子痫前期患者血清对NK细胞杀伤活性影响，实验中同时做了10%及40%血清浓度组，方法同上。并将10%、20%、40%血清浓度组NK细胞杀伤活性进行比较。设效应细胞对照孔：2×104个NK细胞；靶细胞对照孔：1×104个K562细胞。

1.3.6 MTT法检测NK细胞杀伤活性：培养板各孔加入 10μl MTT（5mg/ml）共同孵育 4h。孵育在 37℃、5%CO2培养箱中进行。孵育结束后，弃上清，各孔加二甲基亚砜150μl，微型振荡器振荡10min，酶标仪570nm波长处测A值。

1.3.7 NK细胞杀伤活性计算方法：取3个复孔A值的中间值，按下述方法计算NK细胞杀伤活性，以杀伤率（%）表示。NK细胞活性（%）=［1-（实验组A值-效应细胞组A值）/靶细胞组A值］×100。

1．4 统计学处理

2 结果

2．1 重度子痫前期患者及正常妊娠妇女血清对NK细胞杀伤活性影响。

在用20%重度子痫前期患者及正常妊娠妇女血清孵育20h后，重度子痫前期组NK细胞杀伤活性为（48.68±8.47）%，正常妊娠组为（35.21±8.24）%。与正常妊娠组相比，重度子痫前期组NK细胞杀伤活性增强，差异有统计学意义（P<0.01）。

2．2 不同浓度重度子痫前期患者血清对NK细胞杀伤活性影响

在10%、20%、40%浓度重度子痫前期患者血清作用20h后，10%血清浓度组NK细胞杀伤活性为（39.98±7.65）%，40%血清浓度组为（58.33±7.45）%。10%、20%、40%浓度重度子痫前期3组间两两相比，差异有统计学意义（F=24.326，P<0.01）。

3 讨论

近年研究表明，子痫前期患者外周血NK细胞中 IFN-γ 表达增多［5］，Wilczynski报道［6］子痫前期患者蜕膜中NK细胞比率增多，分泌IFN-Γ增多，而分泌IL-6、IL-10减少。张展等［7］报道子痫前期患者体内NK细胞数量及功能均表现增强状态，从而在妊娠过程中影响母胎免疫耐受。而NK细胞功能变化的具体机制尚不清楚。本研究中，在子痫前期重度患者血清下，NK细胞杀伤活性增强，且在10%、20%、40%血清浓度组，随血清浓度的增加，NK细胞杀伤活性呈现增高趋势，提示子痫前期患者血清中某些因子可能使NK细胞活性增强，子痫前期患者NK细胞功能变化可能与血清中某些因子有关。

子痫前期患者血清导致NK细胞活性增强可能存在以下几个原因：（1）子痫前期胎盘浅着床，组织供血供氧不足，滋养细胞分泌细胞毒性因子入血，如TNF-α、IL-1等，蜕膜淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高［6］，子痫前期患者的血清中含有某种或某些胎盘源性细胞毒性因子，导致NK细胞活性增高；（2）子痫前期患者Th1/T h1细胞因子比例失衡。有实验表明［8］，子痫前期患者外周血单个核细胞分泌Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ水平升高，分泌Th2型细胞因子IL-4、IL-10水平下降。Dong等［9］研究发现子痫前期患者血清IL-2/IL-10TNF-a/IL-10比率与正常妊娠相比明显升高，子痫前期患者血清中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ等能促进NK的活化和增殖，导致NK细胞功能的改变。

活化的NK细胞一方面损害胎盘组织，抑制滋养层的生长，另一方面又可能对血管内皮细胞造成损伤。NK细胞对靶细胞的识别作用为非特异的，不受MHC限制，具有直接杀伤靶细胞的效应。Kitayama等［10］证实IL-2激活的NK细胞不但对异体内皮细胞，对自体内皮细胞也有肯定的杀伤作用。

综上，本研究结果显示重度子痫前期患者血清可使NK细胞杀伤活性增强，提示子痫前期患者NK细胞功能变化与血清中某些因子有关。子痫前期患者血清中诱导NK细胞功能变化的确切因素尚有待于今后进一步研究。

［1］Redman CW，Sargent IL.Immunology of pre-eclampsia ［J］.Am J Reprod Immunol，2010，63（6）：534-543.

［2］Yagel S.The developmental role of natural killer cells at the fetal-maternal interface［J］.Am J Obstet Gynecol，2009，201（4）：344-350.

［3］Wei J，Satomi M，Negishi Y，et al.Effect of sera on adhesion of NK cells to endothelium in severe preeclampsia ［J］.J Obstet Gynecol Re，2006，32（5）：443-448.

［4］乐杰.妇产科学［M］.7版，北京：人民卫生出版社，2008：92-99.

［5］Darmochwal-Kolarz D，Rolinski J，Leszczynska-Goarzelak B，et al.The expressions of intracellular cytokines in the lymphocytes of preeclamptic patients［J］.Am J Reprod Immunol，2002，48（6）：381-386.

［6］Wilczynski JR，Tchorzewski H，Banasik M，et al.Lymphocyte subset distribution and cytokine secretion in third trimester decidua in normal pregnancy and preeclampsia ［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2003，109（1）：8-15.

［7］张展，贾莉婷，常彩红，等.先兆子痫患者母、脐血NK细胞增殖能力及杀伤功能测定［J］.郑州大学学报（医学版），2005，40（4）：688-691.

［8］魏军，尚涛，王德志.妊娠高血压综合征患者外周血单个核细胞产生Th1、Th2型细胞因子失衡的研究［J］.中华围产医学杂志，2003，6（4）：195-198.

［9］Dong M，Wang Z，He J.Serum T helper 1-and 2-type cytokines in preeclampsia［J］.Inter J of Gynecol and Obstet，2005，89（3）：288-290.

［10］Kitayama J，Tsuno N，Yahuhara H，et al.Lysis of endothelial cells by autologous lymphokine-activated killer cells ［J］.Cancer Immunol Immunother，1994，38（5）：317-322.

（编辑武玉欣，英文编辑王又冬）

Effect of the Sera from Severe Preeclamptic Patients on Killing Ability of Peripheral Blood NK Cells

WEI Jun，YANG Zhi-ying，YANG Zai-xia，LIU Cai-xia
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo study the effect of the sera from severe preeclamptic patients on killing ability of peripheral blood NK cells.MethodsNK cells from healthy non-pregnant women were incubated with 10%，20%and 40%serum from severe preeclampsia patients and normal pregnant women for 20hours.The effect of the sera on NK killing ability to K562cells was analyzed by MTT method.ResultsIn 20%severe preeclamptic sera group，NK killing ability to K562cells ［（48.68±8.47）%］was significantly increased compared with that in normal pregnant group ［（35.21±8.24）%］（P<0.01）.The killing ability of NK cells was （39.98±7.65）%in 10%severe preeclamptic sera group，while （58.33±7.45）%in 40%severe preeclamptic sera group.There were significant differences among 10%，20%and 40%severe preeclamptic sera group （F=24.326，P<0.01）.ConclusionThe sera from severe preeclamptic patients might increase the killing ability of NK cells.

preeclampsia；NK cell；killing ability

R714.24

A

0258-4646（2011）02-0137-03

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0952.009

辽宁省博士启动基金资助项目（20071054）

魏军（1968-），女，副教授，博士.E-mail：weij@sj.hospital.org

2010-10-15