细胞体外侵袭实验中Transwell plate染色技术改良

蒋海鹰 颜亚晖 罗庚求 周 庆

（中南大学基础医学院病理学系 湖南长沙410013）

细胞体外侵袭实验主要应用于肿瘤细胞侵袭和转移能力研究。该实验经常使用Transwell plate通过matrigel穿膜侵袭实验来检测肿瘤细胞的侵袭潜能。但在具体实验中获得真实、最佳实验结果图象并借以说明问题并非简单。甚至在实验结果染色时按常规处理，操作复杂，处理不当，易致样本混淆，实验失败［1］。本文采用新鲜配制苏木素染液，利用培养板直接对Transwell plate进行染色，并置于培养板中在倒置显微镜下直接观察，可获满意结果。

材料和方法

1.材 料

Transwell plate，六孔培养板，新鲜配制的苏木素染液，眼科弯镊一把，10%甘油明胶等。

2.方 法

2.1 用镊子小心取出Transwell plate上室，置于标记编号的六孔板相应孔中。用滴管将Transwell上室和孔同时注入PBS，浸泡洗涤2次。

2.2 用PBS湿润的棉签，轻轻擦去上室内的matrigel凝胶和聚碳酸膜上面的细胞，并用PBS侵泡洗涤。

2.3 以95%乙醇侵泡固定Transwell上室穿膜细胞20min，再用PBS洗涤2次。

2.4 以新鲜配制的苏木素染液，侵染3－5min，用自来水浸泡洗涤，自然返蓝。

2.5 伊红浅染，快速洗涤。

2.6 另取洁净六孔板，孔中滴入10%甘油明胶，取已染色好的Transwell上室置于甘油明胶中，即可在倒置显微镜下观察结果。

结 果

穿膜的细胞染色清晰，核浆颜色分明，背景干净，便于计数，见图1，2。

讨 论

1.细 胞的洗涤

在染色过程中，每一步均需洗涤，更换六孔板孔中的PBS或蒸馏水，同时并用滴管将Transwell上室也注满，浸泡洗涤，以降低染色背景，使细胞着色清晰。

2.凝 胶和聚碳酸膜上的细胞擦拭

擦拭凝胶和膜上的细胞时须注意棉签湿润即可，不能滴水；擦拭时，需从一个点开始，有规律的扫描式的擦拭，力度适中，勤换棉签。擦拭前后，均在倒置显微镜下观察，以便了解擦拭程度。如果细胞擦拭不完全，经染色后直接影响观察和细胞计数［2］。

3.苏 木素染液必须新鲜配制

新鲜配制的苏木素细胞着色后，颜色鲜艳清晰，而且染色过程中不需要分化，容易在自来水中自然返蓝。因在侵袭实验中，细胞穿膜后，吸附不是十分牢固，如以成熟的苏木素染色，需在稀酸中分色，再入弱碱液中返蓝，这样容易使细胞脱落，影响结果，固而使用新鲜配制的苏木素染液可避免。

4.六 孔培养板的利用

传统的细胞穿膜侵袭实验结果观察是将聚碳酯膜自上室基底切取下来，置载玻片上中性树胶封片，普通显微镜下观察。而此操作需要格外细心，且容易损伤穿膜的细胞，因而影响结果。利用六孔培养板既避免上述操作，又可防止样本混淆：在六孔培养板各孔标记编号，将Transwell上室置于相应的孔中，经染色后直接在倒置显微镜上观察；而且，六孔板还可用来作为Transwell上室染色、洗涤的容器，可充分漂洗，这样染出来的细胞图片背景干净，细胞清楚。

［1］朱静，万远廉，高嵩.细胞体外侵袭实验常见问题及对策.实用医技杂志，2006，13（15）：2583-2584

［2］孔灵玲，王旭，满冬梅，等.Matrigel穿膜侵袭实验技术改进.济宁医学学报，2006，3：3

图 版 说 明

图1 胃癌细胞SGC7901穿膜侵袭实验。HE染色。×100

图2 胃癌细胞SGC7901穿膜侵袭实验。HE染色。×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1transwell invasive experiment of gastric carcinoma cells SGC7901.HE staining.×100

Fig.2transwell invasive experiment of gastric carcinoma cells SGC7901.HE staining.×200