中间丝蛋白Nestin在不同病程糖尿病大鼠肾组织中的表达

刘 巍 段惠军＊ 张 悦 张 怡 郝 军

(1河北医科大学病理学教研室; 2河北医科大学临床诊断学教研室,石家庄050017;3河北省保定市传染病医院,保定070000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一,是导致终末期肾衰竭的重要原因。蛋白尿是DN重要的临床表现,与病情的严重程度密切相关。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成之一,其结构与功能的改变,在DN的发生发展过程中起着重要作用。Nestin(巢蛋白)属于第Ⅵ类中间丝蛋白,表达于多种组织的干细胞或前体细胞中,被广泛用作干细胞的标志性蛋白之一。Nestin的功能与维持前体细胞的正常形态结构有关,也可与其他中间丝蛋白共聚组装成中间丝发挥细胞骨架作用。最近研究发现,在肾脏已分化成熟的足细胞中有大量Nestin的表达,并且对维持足细胞的正常形态起重要作用[1-2]。实验通过检测Nestin在糖尿病大鼠肾组织中的表达,探讨其在糖尿病肾病发生发展过程中所起的作用。

材料和方法

1.主 要试剂

链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(Sigma公司);Nestin鼠单克隆抗体(Santa Cruz公司);二步法抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(Gene Tech公司);FITC标记山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥公司)。

2.动 物模型及分组

清洁级雄性 Wistar大鼠,体质量120-150g(河北医科大学实验动物中心提供)。STZ按65 mg/kg腹腔注射,溶剂为0.01mol/L的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(p H=4.5),48 h后测空腹血糖,血糖≥16.7mmol/L且尿糖阳性者作为糖尿病(Diabetes mellitus,DM)大鼠。随机分成 DM 2、4、8、12 和 16周组,每一时间点均设鼠龄匹配的正常对照组(n=5),对照组腹腔注射同等剂量的柠檬酸盐缓冲溶液。实验期间各组大鼠均自由饮食,不使用胰岛素或其他降糖药物。

3.动 物标本的留取

DM大鼠成模后,每周测血糖1次,不符合标准的大鼠弃去。分别于成模第2、4、8、12和16周时处死各组DM大鼠及对照的正常组大鼠。处死前1d对大鼠称重,代谢笼收集24h尿液,记录尿量。禁食6-8h,麻醉后称重,股动脉放血收集血液,4℃离心,分离血清,用于生化指标检测;开腹取双侧肾脏,称重,测定肾重/体重(mg·g-1);一侧肾脏固定于4%多聚甲醛供制作石蜡切片用,另一侧肾脏取皮质,部分置于70%乙醇固定后行流式细胞术检测,其余部分于-80℃保存备用。

4.生 化指标测定

采用日立7170-A全自动生化分析仪检测 Glu、BUN、尿蛋白。以肾重(mg)与体重(g)比值作为肾脏指数(Kidney Index,KI)。

5.常 规病理学观察

肾组织石蜡包埋后切片2μm,常规 HE染色,光镜下观察肾组织形态学改变。

6.免 疫组织化学法检测Nestin表达

石蜡包埋肾组织4μm切片,脱蜡至水,应用二步法免疫组化试剂盒检测Nestin表达,阴性对照用PBS代替一抗,DAB显色,苏木素复染。每张切片随即找出10-15个肾小球,经 Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行半定量分析,分别得出每个肾小球中Nestin表达的积分光密度值(IOD),所有肾小球取平均值为该标本的Nestin阳性表达值。

7.流 式细胞术检测Nestin表达

将标本用网搓法制成单细胞悬液,采用间接免疫荧光法,在细胞悬液中加入1∶100稀释的鼠抗Nestin单克隆抗体,37℃温浴30min后生理盐水洗涤,加入羊抗鼠 FITC-IgG,温浴洗涤后行流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司,Epics-XLⅡ型)检测,测量的数据应用相应的程序进行资料处理,测定前以标准样品调整仪器CV值在2%以内。Nestin表达的定量分析以荧光指数(FI)表示其相对含量:FI=(样品的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/对照组组织平均荧光强度。

8.统 计学分析

数据均以均数土标准差(¯x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析,两组间均数比较采用 t检验。

结 果

1.一 般情况

与正常对照组相比,DM组大鼠血糖明显升高,出现多饮、多食、多尿、毛色晦暗等症状,体重下降明显。

2.肾 脏指数(Kidney Index,KI)及血尿生化指标的改变

与同时间点正常对照组相比,DM组大鼠 KI值均出现明显升高,并且在第8周时达高峰,而后略下降。与对照组相比,DM组大鼠血糖、血尿素氮和24 h尿蛋白量从第2周起均出现明显升高(P<0.05或 P<0.01),且随病程进展升高程度加重(表1)。

表1 对照组和糖尿病组肾脏指数、血糖、血尿素氮和24 h尿蛋白量(¯x±s)Table 1 Kidney index,blood glucose,blood urea nitrogen and 24 h urinary protein in control groups and diabetic groups(¯x ±s)

3.肾 组织病理学改变

光镜下各对照组大鼠肾组织均未见病理改变。DM组大鼠从第2周起出现肾小球体积增大,系膜细胞轻度增生;至8周时系膜基质明显增多,系膜区增宽;12、16周时肾小球呈分叶状,肾小管上皮细胞可见明显空泡变性及坏死(图1)。

4.免 疫组化检测Nestin的表达

Nestin在肾脏主要表达于肾小球基底膜外侧足细胞胞浆中,在正常对照组中呈点状或线状分布。DM组Nestin表达水平从第2周起即出现升高,呈粗颗粒状分布在足细胞胞浆中;第8周时Nestin呈团块状分布,表达达高峰;12周以后,Nestin表达开始下降(图2)。Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行半定量分析,结果显示,与正常对照组相比,DM组从第4周起Nestin表达的积分光密度值显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),且在第8周时达高峰(表2)。

表2 Nestin表达的积分光密度值(IOD)(¯x±s)Table 2 IOD of Nestin in different groups(¯x ±s)

5.流 式细胞术检测Nestin的表达

与对照组相比,DM各组Nestin表达均升高,第8周时达到高峰,而后降低(表3)。

表3 流式细胞术检测Nestin的表达(FI,¯x±s)Table 3 The expression of Nestin protein assessed by flow cytometry(FI,¯x ±s)

图1 HE染色检测肾组织病理学变化(×400)。A:对照组;B:2周组;C:4周组;D:8周组;E:12周组;F:16周组Fig.1 HE staining of renal tissue in different groups(×400).A:Control group;B:2 weeks;C:4 weeks;D:8 weeks;E:12 weeks;F:16 weeks

图2 免疫组织化学法检测Nestin的表达(×400)。A:对照组;B:2周组;C:4周组;D:8周组;E:12周组;F:16周组Fig.2 Immunohistochemical staining of Nestin(×400).A:Control group;B:2 weeks;C:4 weeks;D:8 weeks;E:12 weeks;F:16 weeks

讨 论

糖尿病肾病是影响糖尿病患者生存质量的严重并发症,以往研究多集中于系膜区的扩张及基底膜的增厚。但最近的研究发现足细胞的损伤在糖尿病肾病的发生发展过程中起重要作用,是肾小球硬化和慢性肾脏病进展的重要机制[3]。

足细胞是一种具有复杂细胞骨架系统的高度分化的上皮细胞,它最主要的形态学特点是其呈指状连接的足突[4],这些足突由裂孔膜连接,是肾小球滤过膜的最后一道屏障,决定了肾小球选择性滤过的蛋白分子的大小,任何原因引起的足突损伤都可引起蛋白尿,影响肾脏功能[5]。因此,正常而完整的细胞骨架系统是维持足突形态和功能的重要保证。

Nestin(巢蛋白)是一种属于中间丝的细胞骨架蛋白,首先被发现表达于胚胎神经干细胞[6]。随后的研究发现,在多种组织如肌肉、胰岛、皮肤等的干细胞或前体细胞中也有Nestin的表达,因此被广泛用作干细胞的标志性蛋白[7]。最近研究发现,在肾小球中也有Nestin的表达。在发育成熟的肾小球中,Nestin主要表达在分化成熟的足细胞的胞浆及初级足突中,而在肾小球系膜细胞和上皮细胞中没有表达[8]。

Nestin对维持足细胞正常的形态和功能具有重要的作用。应用RNA干扰技术抑制小鼠足细胞中Nestin的表达会使足细胞的形态发生改变,细胞的足突会变短或消失[9]。Zou等[10]采用嘌呤霉素Wistar大鼠肾病模型发现,病变进展至高峰期时,足细胞中Nestin、Vimentin和Desmin等三种中间丝蛋白的表达均有增加的趋势,推测这种表达的增加与足细胞的肥大有关,中间丝蛋白的表达上调可以增加细胞结构的稳定性,使足细胞承受肾小球毛细血管壁高压力的变化。尤莉等[11]采用相同的肾病模型发现,PAN注射后,肾小球中Nestin的表达在初期有一过性增高,随即下降,同时足细胞的足突出现广泛融合,并伴有大量的蛋白尿,推测Nestin参与了蛋白尿的发生及足突的融合。

实验采用STZ腹腔注射复制Ⅰ型糖尿病大鼠模型,观察糖尿病肾损伤后Nestin的表达变化。实验发现,成模后2周,糖尿病大鼠肾小球体积增大,24 h尿蛋白量开始增多。免疫组织化学和流式细胞术检测结果显示,Nestin表达在成模后2周开始增多,并随病程进展逐渐升高,第8周时其程度达高峰,而后略有下降。我们推测该变化可能是由于糖尿病时肾小球滤过率增高,足细胞通过代偿性肥大和细胞骨架的改变,以对抗增高的毛细血管内压力,维持细胞稳定。但是,当足细胞损伤加重,代偿机制逐渐失效时,Nestin的表达则开始出现下调。

关于Nestin的蛋白结构,与其他类别的中间丝蛋白不同,其N端较短,不能独立形成同源二聚体,必需和其他中间丝分子一起形成异源二聚体,而其C端较长,使其可以连接其他中间丝的同源二聚体。这些特征使Nestin成为连接细胞骨架蛋白的桥梁[12-13]。免疫共沉淀研究显示,抗Nestin抗体不但可以沉淀Nestin,还可以沉淀其他细胞结构蛋白如Ⅲ类中间丝蛋白 vimentin、Ⅳ类中间丝蛋白α-internexin,提示Nestin可能通过与其他种类的中间丝蛋白结合,共同参与细胞骨架结构的组装和调节[14]。我们的研究推测Nestin表达变化可能与糖尿病肾病足细胞损伤及病情的发展密切相关,但其具体的作用机制及与其他类型中间丝蛋白的关系尚需进一步研究。

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