抑制自噬促进冬凌草甲素诱导的多发性骨髓瘤细胞凋亡涉及胞内ROS产生

曾 蓉 陈 燕 崔国惠

(华中科技大学附属协和医院血液病研究所,湖北武汉 430022)

冬凌草甲素 (oridonin,Ori),为一类双萜类化合物,提取自碎米椏植物中,具有多种药理和生理作用,例如抗炎和抗菌作用等,其在抗肿瘤方面的作用研究逐渐成为热点[1-3]。至今为止,一些体内外实验均证实冬凌草甲素可以诱导某些肿瘤细胞发生凋亡和自噬[4-6],但是关于两者之间的关系、两者对肿瘤细胞生存的影响以及涉及的分子机制研究才刚刚起步。

自噬是一通过溶酶体分解胞质成分的过程,主要有3种形式的自噬:巨自噬(以下简称自噬);微自噬以及伴侣分子介导的自噬。自噬由一系列连续步骤完成,以自噬小体的形成为特征[7,8]。随着各种自噬相关基因的发现,自噬的分子过程也逐渐清晰,在众多的自噬相关基因中最为重要的基因包括Beclin1和LC3。Beclin1为Atg6的同源类似物,介导自噬起始[9-11]。微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),为Apg8p的同源类似物,其在自噬小体膜形成中至关重要。LC3具有两种形式-LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ主要以弥漫的形式位于胞浆中,当自噬发生时,被处理为LC3-Ⅱ并参与构成自噬小体膜,在细胞内以点簇状形式存在,因此Beclin1的蛋白表达水平以及LC3-Ⅱ自噬小体膜定位通常用来作为判断自噬水平的指标[9-11]。凋亡——程序性细胞死亡Ⅰ型(PCDⅠ),是一种受基因调控的细胞自杀过程,其形态学特征为核膜周边染色质凝集、核凝集、细胞器保留比较完整以及吞噬小体的缺失。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是一类生存周期短、具有活性的含氧化合物,主要包括超氧阴离子、氧自由基、过氧化合物等。虽然在线粒体在正常氧化呼吸时也不可避免的产生少量的ROS,在生理状态下低水平的ROS能被一些抗氧化酶和物质降解,然而中、高度的ROS产生导致ROS胞内蓄积从而引起氧化应激反应。ROS能直接氧化蛋白、脂质以及DNA引起一系列细胞反应。大量研究已经证实ROS产生通过增加线粒体膜通透性直接启动凋亡[12,13]。

本实验研究了冬凌草甲素作用于多发性骨髓瘤RPMI8226细胞诱发自噬和凋亡,两者之间的关系以及ROS的作用。

材料和方法

1.材 料

人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞购自ATCC;四甲基偶氮唑盐(MTT)、冬凌草甲素、3-甲基腺素(3-MA)、NAC(N-Acetyl-L-cysteine,N-乙酰-L-半胱氨酸)、DCFH-DA(2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐)荧光探针、抗人单克隆抗体γ-tubulin购自美国Sigma公司;RPMI1640培养液购自美国 Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;凋亡试剂盒(TUNEL)购自博士德生物有限公司;抗人单克隆抗体LC3购自美国Abcam公司;抗人多克隆抗体Beclin1购自美国Santa cruz公司。

2.方 法

2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养细胞于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。当细胞到达对数生长期后,用相应浓度的Ori处理细胞。Ori处理前1h加入5m mol/l NAC预处理,用以抑制胞内ROS产生。Ori处理前1h加入5m mol/l 3-MA预处理,用以抑制自噬。

2.2 MTT比色实验

用含10%胎牛血清的 RPMI1640培养基将RPMI8226细胞配成单个细胞悬液,以每孔1×105/ml的浓度接种于96孔板中,每孔体积200μl。将接种细胞的96孔板置于CO2培养箱中,以37℃、5%CO2、饱和湿度分别培养12h、24h和48h,Ori的工作浓度分别为 1、2、4、8、16、32、64μmol/l。细胞经实验处理后,每孔加入20μlMTT溶液(5 mg/ml),继续于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育4h。结束后,平板离心机以1000rpm转速离心5min,小心吸弃上清,于每孔中加入150μl DMSO,振荡并充分溶解结晶15min。选择激发波长490nm,参考波长650nm,在 ELX800型酶标仪上分析各孔光密度(OD)值,并记录计算细胞增殖抑制率:(对照组OD值–对照调零组OD值)– (实验组OD值– 实验调零组OD值)/(对照组OD值–对照调零组OD值)×100。

2.3 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡

收集经10μmol/l Ori处理24h的细胞,并以未经Ori处理的细胞作为对照,根据使用说明进行实验。在光学显微镜下观察并记录实验结果,显微镜下共计数500个细胞,计算调亡率:凋亡率(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%

2.4 利用QDs605nm-Anti-LC3荧光探针免疫荧光定位LC3

(1)QDs605nm-Anti-LC3荧光探针制备:根据武汉大学化学和生物分子学院提供的步骤进行荧光探针制备[14]。简要步骤如下:用巯基乙酸活化过的QDs605nm溶解于含50 mmol N-(3-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亚胺 氯化氢和5 mmol N-羟基丁二酰亚胺的 PBS中;接着于20μl抗人LC3单克隆抗体在室温下振荡孵育2-4h;6000g室温离心10分,获取上清并微孔透析 8-12h获得较纯的QD605nm-Anti-LC3探针,4℃保存。

(2)免疫荧光反应:收集经实验处理后的细胞,PBS洗涤2次,4%多聚甲醛4℃固定1h;PBS洗涤2次,将细胞涂于经1%明胶预先包被过的载玻片上,在超净工作台上干燥制片;用0.1%Triton X-100滴于载玻片细胞面,在室温下破膜10分;接着将终浓度为 1×10-7mol/l的 QD605nm-Anti-LC3探针溶液滴加在载玻片细胞面,室温孵育4h;PBS洗3次,封片。

(3)荧光显微镜下观察:以605nm激发波长观察,LC3-Ⅰ在胞浆内弥散分布,LC3-Ⅱ呈点簇状分布,故红色的斑点状荧光表示LC3-Ⅱ的自噬小体膜定位。至少计数500个细胞并计算红色斑点状荧光阳性细胞率%:红色斑点状荧光阳性细胞率%=红色斑点状荧光阳性细胞数/总细胞数×100。

2.5 免疫印记实验

利用western blot检测细胞Beclin1蛋白水平,收集经实验处理的细胞,用预冷的 PBS洗涤2次,然后重悬于细胞裂解液,于冰上裂解30min,期间超声裂解 3次,裂解后在 4℃以 12000rpm离心15min,收集上清即总蛋白质液。用BCA法测定蛋白浓度后,用5×上样缓冲液(终浓度为1×)和双蒸水稀释各蛋白样品至同一浓度备用。取等量的蛋白样品进行 SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育等步骤后,用 ECL孵育后,X光胶片曝光,曝光显影的目的条带用ImageJ image处理软件进行半定量分析,以内参为参考标准计算出目的条带标准化后的光密度值,并以此判断蛋白的表达水平。

2.6 测量胞内ROS产生

收集经实验处理后的细胞,RPMI1640洗涤2次。细胞重悬于终浓度为25μmol/L DCFH-DA溶液中,轻轻吹打混匀,37℃孵育30min。DCFH-DA探针装备完成后,用 RPMI1640培养 洗涤细胞2次,用流式细胞术以激发波长488nm,用一波长为515 nm的通带滤器检测DCF荧光。

2.7 统计学分析

应用统计学软件SPSS 13.0做统计学分析,数据以均数±标准差(mean±S.D.)表示,组间比较采用独立样本t检验,P<0.05认为有统计学意义。

结 果

1.冬 凌草甲素抑制RPMI8226细胞增殖

分别以 1、2、4、8、16、32 umol/L 的 Ori作用于RPMI8226细胞12h、24h和48h。根据MTT分析,如图1所示,Ori能明显抑制细胞增殖,其细胞增殖抑制作用呈时间-、剂量-依赖性,其48h的 IC50为5.16μmol/L。

图1 Ori对RPMI8226细胞增殖抑制作用的时效、量效分析不同浓度的 Ori(1、2、4、8、16、32u mol/L)分别作用 RPMI8226细胞12h,24h和48h。Fig.1 Assessment of time-and dose-effect of proliferative inhibition induced by Ori in RPMI8226 cellsRPMI8226 cells were treated with Ori at various concentrations(1,2,4,8,16,32u mol/L)for 12h,24h and 48h.

2.冬 凌草甲素通过胞内ROS产生诱导RPMI8226细胞凋亡

利用TUNEL和流式细胞术分别检测10μmol/L Ori作用0h,24h后RPMI8226细胞凋亡和胞内ROS水平。如图2a所示,与0h相比,Ori处理24h后TUNEL阳性细胞显著增多,计算凋亡率为58.91±3.43%,明显高于0h(6.01±0.62%,P<0.01),表明Ori诱导细胞凋亡。如图2b所示,随着凋亡的增加,胞内ROS产生,24h细胞DCF平均荧光强度明显高于0h(41018.27±392.71 versus 26853.33±587.44,P<0.01)。

为了进一步探讨胞内ROS产生在Ori诱导凋亡过程中的作用,用5 mmol/L自由基清除剂NAC预处理细胞1h,然后Ori作用24h,重复上述实验检测胞内ROS水平和凋亡并与Ori处理组比较。如图2b所示,与Ori处理组相比,NAC预处理组DCF平均荧光强度明显下降至基础水平(25899.81±601.71),NAC完全抑制了Ori导致的胞内ROS产生,同时细胞凋亡消失(5.93±1.13%)(见图2a)。

以上结果说明胞内ROS产生对Ori诱导凋亡至关重要,换言之,Ori通过胞内ROS产生诱导细胞凋亡。

3.冬 凌草甲素诱导RPMI8226细胞自噬

利用QDs605nm-Anti-LC3荧光探针免疫荧光技术和western blot分别检测 RPMI8226细胞经10μmol/L Ori处理0h,24h的LC3胞内定位和Beclin1蛋白水平。如图3a所示,与0h相比,Ori作用24h红色点簇状荧光阳性细胞明显增多,且红色点簇状荧光细胞阳性率也显著升高(89.67±4.65%versus 14.13±3.05%)。Western blot检测分析Beclin1的蛋白水平发现24h蛋白水平明显高于0h(见图3b)。以上结果说明Ori除了诱导凋亡外还能同时诱导细胞自噬。

图2 Ori处理组、NAC预处理组和3-MA预处理组凋亡和胞内ROS产生变化RPMI8226细胞分别以10μmol/L Ori处理0h和24h、先以5m mol/L NAC或5m mol/L 3-MA预处理1h后经10μmol/L Ori处理 24h。(a)TUNEL检测细胞凋亡;(b)流式细胞术分析DCF荧光强度。直方图中的数据均以均数±标准差(mean±S.D,n=3)表示 ,＊P<0.05,＊＊P<0.01。Fig.2 Assessment of intracellular ROS level in Ori-treated,NAC-pretreated and 3-MA-pretreated groupsRPMI8226 cells were pre-treated with 5m mol/L 3-MA or NAC for 1h,and then treated with 10u mol/L Ori for 24h.Cells were alone-treated with 10μmol/L Ori for 0h and 24h.(a)apoptosis detected by TUNEL;(b)DCF fluorescent intensity analyzed by FCM.Columns,mean of three independent experiments;Error bars,±S.D;＊P<0.05,＊＊P<0.01

图3 Ori处理组和3-MA预处理组自噬变化

图3 b western blot检测Beclin蛋白水平并以γ-tubulin作为内参应用ImageJ image处理软件进行半定量分析。直方图中的数据均以均数±标准差(mean±S.D.,n=3)表示,＊＊P<0.01,＊P<0.05(b) Beclin1 protein levels were detected by western blot assay.γ-tubulin was used as an equal loading control.The bands were quantified by ImageJ image software.Columns,mean of three independent experiments;Error bars,±S.D.;＊P<0.05,＊＊P<0.01

4.在RPMI8226细胞中,胞内ROS产生参与了抑制自噬上调促进冬凌草甲素诱导细胞凋亡的过程

以上的实验结果已经说明凋亡是Ori所致的细胞死亡的途径之一,为了进一步探讨自噬在细胞死亡中充当的角色,以及自噬和凋亡之间的关系,自噬抑制剂3-MA引入了实验研究,细胞先经5 mmol/L 3-MA预处理1h,然后10μmol/L Ori作用24h。重复上述实验检测自噬、凋亡和胞内ROS产生。如图3a,b所示,3-MA预处理组红色点簇状荧光细胞阳性率(39.87±2.93%)以及Beclin1蛋白水平明显低于Ori处理组(P<0.01)。如图2a,b所示,3-MA预处理组调亡率(81.33±4.83%)和DCF平均荧光强度(59811.37±322.16)均明显高于Ori处理组(P<0.05)。

上述结果表明自噬并非细胞死亡的途径而充当细胞保护机制。抑制自噬通过上调胞内ROS产生促进Ori诱导的细胞凋亡。

讨 论

冬凌草甲素,一种潜在的抗肿瘤药物,已经证实在多种肿瘤细胞系中同时诱发自噬和凋亡,包括Hela细胞、A431细胞等[5,15]。自噬和凋亡之间的关系研究结果说法不一,普遍认为在不同的细胞中、不同的条件下,两者之间的关系也随之不同。Jia等人发现自噬对 TNF-α诱发 T淋巴细胞白血病细胞凋亡至关重要,凋亡的发生依赖于自噬的发生[16]。在另外的实验体系中,发现自噬拮抗或延缓凋亡,通过抑制自噬可以促进细胞凋亡[15,17]。在本实验中,同样发现Ori同时诱发RPMI8226细胞凋亡和自噬,利用公认的自噬抑制剂3-MA抑制自噬后,发现Ori诱导的细胞凋亡增加,说明虽然Ori同时诱导了细胞自噬和凋亡,但自噬抑制细胞凋亡,为细胞促生存机制,凋亡才是细胞死亡的主要途径。

胞内ROS产生介导很多细胞生理和病理反应,高水平的ROS与细胞凋亡密切相关。ROS参与凋亡作用已经被大量的研究证实[12,13]。在本实验中,Ori同时诱发胞内 ROS产生和凋亡,用NAC完全抑制胞内ROS后,凋亡也不能再被诱导,说明在此Ori诱导细胞凋亡是经 ROS介导的,且胞内 ROS产生是Ori诱导细胞凋亡的关键机制。有研究表明自噬能有效缓解胞内ROS产生缓解应激压力发挥其促生存作用[20-21],在本研究中,利用3-MA抑制自噬后,细胞凋亡增加的同时胞内ROS水平也随之进一步升高,说明胞内ROS产生参与了抑制自噬促进Ori诱导的凋亡的过程。以上发现为深入研究Ori治疗多发性骨髓瘤的分子机制、靶点提供了新的契机。

综上所述,在本实验中发现Ori同时诱导细胞凋亡和自噬;胞内ROS产生是Ori诱发多发性骨髓瘤细胞凋亡的关键机制;阐明自噬通过缓和胞内ROS产生拮抗凋亡,为促进Ori抗肿瘤疗效提供了一个可行的方案。以上研究结果提供有关Ori诱导凋亡和自噬机制的新信息,为MM的治疗提供新思路。

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