紫杉醇所致SD大鼠外周神经病变模型的建立

迟晓丽，邵 璇，周文霞，张永祥

（军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850）

化疗药诱导的外周神经病变（chemotherapyinduced peripheral neuropathy，CIPN）［1］是多种化疗药物的共同而严重的不良反应，如铂类、紫杉酚类、埃博霉素、长春花属生物碱类，以及硼替佐米（bortezomib）和来那度胺（lenolidamide）等新上市的化疗药，主要表现为感受神经元异常和神经痛。CIPN目前已成为肿瘤化疗中最主要的剂量限制因素之一［1］，严重影响了化疗药的疗效。如，高居世界抗肿瘤药物销售额之首的紫杉醇类药物在临床使用中所导致的外周神经病变并不会随着停药而得到缓解，而是持续数月甚至数年，并且对目前临床上所使用的任何镇痛药物都不敏感，常导致一部分患者被迫减量直至停药，从而影响化疗效果甚至使化疗归于失败，严重影响患者的生存质量［2］。目前尚无有效的 CIPN治疗药物问世。因此，建立CIPN动物模型并在此基础上研制可以缓解甚至治愈CIPN的药物是当务之急。近十年来，国内外在建立CIPN动物模型上进行了诸多尝试，取得了明显进展，其中最常用的是使用PTX腹腔注射建立成年雄性SD大鼠外周神经病变模型［3］。但是关于影响CIPN模型建立的相关因素却少有涉及，在此基础上筛选和评价CIPN药物的研究更是凤毛麟角。本研究拟考察影响PTX所致SD大鼠CIPN模型的影响因素，为筛选和研究防治CIPN药物提供理想的动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SD大鼠，雄性，180～220 g，350～400 g，由军事医学科学院实验动物中心提供［SCXK（军）2002-001］。每2只饲养于不锈钢丝笼中，自由摄食饮水。

1.1.2 药品及试剂：紫杉醇，购自北京华素制药股份有限公司，批号0810201。溶剂聚氧乙基蓖麻油/无水乙醇（1∶1）由茹祥斌教授提供。兔抗人PGP9.5多抗，Abcam公司，美国；小鼠抗大鼠MHC class IIRT la（OX-6）单抗，Abcam公司，美国；Cy3标记驴抗兔IgG，BioLegend公司，美国；FITC标记驴抗小鼠IgG，Santa Cruz公司，美国。

1.1.3 动物分组及给药：动物分为溶剂对照组和给药组，每组2～9只动物。紫杉醇以1∶1的聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor，CrEL）和无水乙醇做为溶媒，隔日一次腹腔注射给药，2 mg·kg-1·次共注射4次。

1.2 实验方法

1.2.1 机械致痛行为学实验：行为学实验和给药由不同的实验者进行。大鼠放在抬高的铁丝网上，每只大鼠使用一个透明的有机玻璃盒（30 cm×20 cm ×15 cm）将其罩在下方，限制其活动范围于此玻璃盒内，任其自由活动5 m in后开始行为学实验。机械性异常性疼痛、机械性痛觉过敏分别通过4 g和15 g折力的测痛丝进行测试。每只大鼠测试时都遵循折力由小到大的顺序进行。测痛丝刺激大鼠后足掌底中部（避开突起部位）5 s，每种折力的测痛丝刺激每只后足5次，每只大鼠共刺激10次。每只大鼠两只后足对4 g、15 g测痛丝刺激的反应次数和总刺激次数的百分比分别作为该只大鼠的机械性异常性疼痛、机械性痛觉过敏的程度。

1.2.2 免疫细胞化学实验检测表皮下神经纤维：SD大鼠腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥钠。先用含有0.05％ 碳酸氢钠和0.1％亚硝酸钠的PBS快速灌流1 m in，然后灌流250 m L新鲜配置的PB（0.1 M，含4％多聚甲醛，pH 7.4）30 min。切断SD大鼠后足，在上述固定液中固定过夜。次日取SD大鼠后足底的一块远离跟骨、靠近足底突起的皮肤，在含30％蔗糖的PB溶液中4％冷藏保存过夜。包埋冷冻后低温恒温切片（30μm）。在含有10％普通驴血清的PBS+T中室温孵育1 h。使用含有5％普通驴血清的rabbit anti-human PGP9.5一抗（1∶6400稀释）4℃孵育24 h。PBS+T清洗后，donkey antirabbit IgG二抗 Cy3标记（1∶200稀释）孵育1.5 h。mouse anti-rat MHC class II RT la（OX-6）一抗（1∶400稀释）孵育1.5 h。PBS+T清洗后，donkey antimouse IgG二抗FITC标记（1∶30稀释）孵育1.5 h。使用荧光显微镜10x和20x物镜，观察和表皮相连的表皮下神经纤维 （intraepidermal nerve fiber，IENF）的形态和数目，IENF没有最短长度要求，在表皮内分支的IENF计为1根。

1.2.3 电镜检测坐骨神经细胞线粒体：大鼠如上述方法固定后取大腿中部约5 mm的坐骨神经，在上述固定液中固定3h。将组织转移至含有10％蔗糖的0.1M PB中，在4℃放置至少12 h。将组织转移至含1％四氧化饿的0.1M PB（pH7.4）中，在4℃放置2 h。室温下，在浓度梯度上升的乙醇和环氧丙烷中将组织脱水。随后将组织包埋于环氧树脂中。使用钻石刀头的超薄切片机制作70 nm切片，Formvar包裹的网收集超薄切片。将切片进行柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色。将切片置于80kV的电镜下镜检，3130x用于观察大致情况，24400x用于线粒体计数。

从表2可以看出，处理能增加西瓜坐果率、提高单瓜重、每公顷产量提高4617 kg、处理比对照每公顷产量提高了15.8%，中心糖度提高了2.4度。

1.3 数据处理和统计学分析

实验结果数据以“均数±标准差”表示，采用SPSS v18.0软件进行具有一个重复测量的方差分析。

2 结果

2.1 PTX对SD大鼠一般情况的影响

实验期间未观察到5组大鼠出现脱毛、腹泻、运动失常等情况。每2 d或3d测定大鼠体重一次。从图1（A）和（B）的体重动态观测表中可以看出，腹腔注射4次2 mg/kg PTX对SD大鼠的体重增长没有明显的影响。

2.2 PTX对SD大鼠机械性异常性疼痛的影响

从图2（A）、（B）可以看出，经2 mg/kgPTX腹腔注射4次处理后，实验全程均没有观察到初始体重200 g的SD大鼠有明显的机械性异常性疼痛，但在17 d可以观察到初始体重400 g的SD大鼠有明显的机械性异常性疼痛。

2.3 PTX对SD大鼠异常性疼痛过敏的影响

2.4 PTX对SD大鼠后足表皮下神经纤维的影响

对大鼠后足表皮切片进行免疫荧光染色检测，IENF图4中粗红线是表皮，表皮下的亮红色丝状物即PGP9.5抗体标记的IENF。从图4（彩插2）中可以看出，对照组SD大鼠表皮下IENF分布均匀且数量较多，但却几乎观察不到紫杉醇模型组SD大鼠的表皮下IENF的存在。表明，PTX处理后会导致SD大鼠后足表皮下IENF断裂，IENF密度显著降低（图5）。

2.5 PTX对SD大鼠坐骨神经细胞线粒体的影响

图6中箭头表示正常线粒体，带横线的箭头表示空泡变性的异常线粒体。从图5中可以看出，对照组SD大鼠的坐骨神经感觉神经元轴突中正常线粒体的比例较高，异常线粒体较少，而PTX处理后空泡变性的异常线粒体明显增多。

图1 紫杉醇对SD大鼠体重的影响。（A）初始体重200 g SD大鼠；（B）初始体重400 g SD大鼠。Mean±SD，n=2-9。其中对照组2只，模型组9只SD大鼠

3 讨论

紫杉醇最先是从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）的树皮中分离出来的治疗实体瘤的最有效和最常用的化疗药物之一。其常见的毒副作用有三种：骨髓抑制、肾毒性和外周神经毒性。骨髓抑制和肾毒性可以通过粒细胞集落刺激因子和大量饮水而分别得到很好的改善。但是，由于缺乏对其治病机制的了解和有效的治疗方法，紫杉醇的外周神经毒性仍然是其严重的剂量限制因素。紫杉醇可导致患者的感受神经元异常和神经痛等的严重的化疗药所致外周神经病变，包括机械性异常性疼痛、机械性痛觉过敏、冷敏异常性疼痛、持续性灼烧痛、麻刺感和麻木等症状，并且这些症状不会随着化疗药的停药而得到缓解，而是持续数月甚至数年［2］。同时由于CIPN多对目前临床上所使用的镇痛药物不敏感，常导致一部分患者被迫减少化疗药的剂量甚至停药，从而影响化疗效果甚至使化疗归于失败。迄今为止，CIPN发生发展的机制尚未完全阐明，也没有可以有效缓解或治疗CIPN的药物问世［4，5］。

图2 紫杉醇致SD大鼠机械性异常性疼痛的动态观测图。（A）初始体重200 g的SD大鼠组；（B）初始体重400 g的SD大鼠组。Mean±SD，n=2-9，其中对照组2只，模型组9只SD大鼠。＊＊P＜0.01，和对照组相比。

图3 紫杉醇致SD大鼠机械性痛觉过敏的动态观测图。（A）初始体重200g的SD大鼠组；（B）初始体重400g的SD大鼠组。Mean±SD，n=2-9。其中对照组2只，模型组9只SD大鼠。＊＊P＜0.01*P＜0.05，和对照组比

图5 紫杉醇对SD大鼠表皮下神经纤维密度的影响。Mean±SD，n=3，＊＊P＜0.01，与对照组比。

图6 紫杉醇对SD大鼠坐骨神经感觉神经元轴突异常线粒体的影响。电镜镜检SD大鼠坐骨神经感觉神经元轴突线粒体，20000×～40000×。箭头表示正常线粒体，带横线的箭头表示空泡变性的异常线粒体。（A）对照组；（B）PTX组

有国外学者应用紫杉醇腹腔注射建立SD大鼠外周神经病变模型，但各种模型的建立条件及方法（如给药剂量、给药频率、动物品系、测定方法等）差别很大。值得注意的是，不同品种的实验动物在筛选CIPN有效药物时可能有不同的表现，从而得出不同的结论。有少量文献采用了 W istar大鼠、C57BL/6和 ddY等小鼠作为模型动物［4-8］。本实验室也曾尝试使用小鼠作为CIPN的模型动物，但前期工作表明，KM小鼠并不适合用作该病症的模型动物，因为KM鼠活泼好动，放置在带铁丝网的高架台上30 m in后仍未处于静息状态，若此时强行进行行为学测痛实验，恐不能正确反映小鼠的痛觉状态。而C57BL/6的情况则稍好些，在大约30 m in时就进入静息状态，但仍比SD大鼠耗时（5min）要长。由于使用小鼠建立的 CIPN模型持续时间短（4～5 d）［7］，和临床 CIPN症状的长时间持续（～3个月）有相当大的差距，因此小鼠用作CIPN模型动物是否能够准确反映临床症状还是值得怀疑的。

目前较多采用的是SD大鼠作为CIPN模型动物。Sarah J.L.Flatters等采用大鼠腹腔隔日（0，2，4，6 d）注射2 mg/kg紫杉醇，总计8 mg/kg［9-11］。陈治军等采用大鼠腹腔隔日（1，3，5，7 d）注射1 mg/ kg紫杉醇，总计 4 mg/kg［12］。据报道，紫杉醇致外周神经病变属剂量限制性毒性，没有量效关系，因此选择能观察到明显病变且未出现明显全身毒性的剂量为佳。本研究对大鼠采用2 mg/kg隔日注射共4次的方法，观察到初始体重为400 g的大鼠表现出神经病变，并且其后足IENF断裂、密度明显降低表明外周神经病变程度严重，而此时大鼠体重并未发生明显变化，表明造模剂量合适。

目前研究CIPN的方法包括机械缩足反射（分为特定刺激力度缩足比率、缩足阈值测定两种方式检测）、热敏实验（热板反射）和冷敏实验（丙酮实验）。陈治军等使用的是机械缩足反射（缩足阈值测定）和热敏实验方法［12］；Shad B.Sm ith等通过考察10种封闭群小鼠的紫杉醇致外周神经病变模型建立可行性，发现该10种小鼠对热敏均不敏感，而对机械缩足反射（特定刺激力度缩足比率）及冷敏实验非常敏感［8］；Sarah J.L.Flatters等同样单独采用机械缩足反射（特定刺激力度缩足比率）或连同冷敏实验进行考察［5，9，10，11］。Elizabeth J.Rahn等采用机械缩足反射法测定缩足阈值［13］。日本学者Takao Hidaka等考察芍药甘草汤对紫杉醇致外周神经病变的改善效果时采用的是改进过的机械缩足反射方法（特定刺激力度缩足比率）［7］。我们对各种文献进行统计发现，采用机械缩足反射测定特定刺激力度缩足比率的报道最多，该实验周期较长（约为20～30 d）［5，9，10，11］，更能模拟临床状态，结果更可靠；而采用机械缩足反射测定缩足阈值的报道略少，且实验周期较短（5～7 d），更适合作为预实验或CIPN药物的筛选和初步评价。本研究即选择了更能模拟临床状态的机械缩足反射测定特定刺激力度缩足比率的方法。

采用机械缩足反射法测定大鼠疼痛常用4-15 g折力的测痛丝。由于正常大鼠受到4 g折力测痛丝的刺激很少发生缩足反射，而CIPN模型大鼠受到4 g折力的刺激会出现明显的缩足反射，因此4 g折力对大鼠足底的刺激所引起的反应最能够代表机械性异常性疼痛。正常大鼠受到15 g折力的测痛丝刺激后有大约5～20％的几率发生缩足反射，而CIPN模型大鼠受到15 g折力的刺激出现缩足反射的几率显著增加，因此15 g折力的测痛丝对大鼠足底的刺激所引起的反应最能代表机械性痛觉过敏［5］。

本研究发现，在应用同样剂量的紫杉醇、同样的给药方式和给药频率的情况下，体重在350～400 g之间的SD大鼠比180～220 g之间的 SD大鼠所表现出来的外周神经病变程度更为严重、持续时间更长，更适合于进行治疗药物筛选和评价。至于初始体重400g左右的SD大鼠对紫杉醇所致外周神经病变更为敏感的原因，我们分析认为，可能是由于初始体重400g的SD大鼠的有效剂量较大，也可能与老年大鼠对化疗药所致外周神经病变更为敏感有关，还有待进一步的研究。

综上所述，给予初始体重400g的SD大鼠隔日腹腔注射2 mg/kg的PTX共4次的方法成功建立了紫杉醇致外周神经病变动物模型，与临床 CIPN患者所表现出来的典型症状和长时间持续的特征一致，该模型能够较为准确地模拟临床相关症状。本研究报道了体重/月龄、造模药物剂量可能对紫杉醇致SD大鼠外周神经病变模型有重要影响，为筛选缓解紫杉醇和长春新碱所致外周神经病变的药物建立相对稳定、可靠的动物模型，并为探讨CIPN发生的机制奠定了一定基础。

［1］Wolf S，Barton D，Kottschade L，Grothey A，Loprinzi C.Chemotherapy-induced peripheral neuropathy：prevention and treatment strategies［J］.Eur JCancer.2008，44（11）：1507-1515.

［2］Kawashiri T，Egashira N，Itoh Y，Shimazoe T，Ikegami Y，Yano T，Yoshimura M，Oishi R.Neurotropin reverses paclitaxelinduced neuropathy without affecting anti-tumour efficacy［J］.Eur JCancer.2009，45（1）：154-163.

［3］Lacouture ME，Melosky BL.Cutaneous reactions to anticancer agents targeting the epidermal growth factor receptor： a dermatology-oncology perspective［J］.Skin Therapy Lett.2007，12（6）：1-5.

［4］Pascual D， Goicoechea C， Burgos E， Martín MI.Antinociceptive effect of three common analgesic drugs on peripheral neuropathy induced by paclitaxel in rats［J］.Pharmacol Biochem Behav.2010，95（3）：331-337.

［5］Flatters SJ，Bennett GJ.Ethosuxim ide reverses paclitaxel-and vincristine-induced painful peripheral neuropathy［J］.Pain.2004，109（1-2）：150-161.

［6］Gauchan P，Andoh T，Kato A，Sasaki A，Kuraishi Y.Effects of the prostaglandin E1 analog limaprost on mechanical allodynia caused by chemotherapeutic agents in mice［J］.J Pharmacol Sci.2009，109（3）：469-472.

［7］Hidaka T，Shima T，Nagira K，Ieki M，Nakamura T，Aono Y，Kuraishi Y，Arai T，Saito S.Herbalmedicine Shakuyaku-kanzoto reduces paclitaxel-induced painful peripheral neuropathy in mice［J］.Eur JPain.2009，13（1）：22-27.

［8］Smith SB，Crager SE，Mogil JS.Paclitaxel-induced neuropathic hypersensitivity in mice responses in 10 inbred mouse strains［J］.Life Sci.2004，74（21）：2593-2604.

［9］Flatters SJ，Xiao WH，Bennett GJ.Acetyl-L-carnitine prevents and reduces paclitaxel-induced painful peripheral neuropathy［J］.Neurosci Lett.2006，397（3）：219-223.

［10］Jin HW，Flatters SJ，Xiao WH，Mulhern HL，Bennett GJ. Prevention of paclitaxel-evoked painful peripheral neuropathy by acetyl-L-carnitine effects on axonal mitochondria，sensory nerve fiber terminal arbors［J］.Exp Neurol.2008，210（1）：229-237.

［11］Xiao WH，Bennett GJ.Chemotherapy-evoked neuropathic pain Abnormal spontaneous discharge in A-fiber and C-fiber primary afferent neurons and its suppression by acetyl-L-carnitine［J］.Pain.2008，135（3）：262-270.

［12］陈治军，田玉科，罗放，曹菲，王平.紫杉醇致大鼠外周神经病理性疼痛模型的建立［J］.华中科技大学学报（医学版），2008，37（6）：785-790.

［13］Rahn EJ，Zvonok AM，Thakur GA，Khanolkar AD，Makriyannis A，Hohmann AG.Selective activation of cannabinoid CB2 receptors suppresses neuropathic nociception induced by treatment with the chemotherapeutic agent paclitaxel in rats［J］.JPharmacol Exp Ther.2008，327（2）：584-591.