SP和CGRP在炎症性肠病大鼠结肠中的表达规律

张 峰，袁川评，柳巨雄，曾 林，胡娟峰

（1.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071；2.吉林大学，长春 130062）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种在我国及欧美等诸多国家极为普遍的慢性胃肠道疾病，其病因和发病机制尚不明确，主要与环境、遗传、免疫等多种因素密切相关［1］。而胃肠肽类激素不仅作为肽能神经递质发挥作用，同时也参与了 IBD发病的神经免疫机制。其中 P物质（substance P，SP）和降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）分别作为兴奋性和抑制性神经递质的代表，在IBD发病中的作用越来越受到关注。为了观察SP和CGRP在IBD大鼠结肠组织中的表达规律来探讨二者在IBD发病机制中的意义，我们采用三硝基苯磺酸 （TNBS）化学诱导建立IBD大鼠动物模型，采用 real-time RT-PCR方法检测SP和CGRP于建模后不同时期（第0、3、7、14、21、28天）结肠组织中的mRNA表达水平的变化，为进一步确定二者在炎症性肠病过程中发挥重要作用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

未成年雌性W istar大鼠60只，体重（120±10） g，清洁级（由吉林大学基础医学部实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-（吉）2007-0003），随机分为PBS对照组20只，模型组40只。放置于（23± 1）℃、湿度＜60％的环境中分笼饲养，并正常饮水摄食。5％三硝基苯磺酸 （trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 建模：采用本实验室常用建模方法，即对W istar大鼠进行24 h禁食不禁水处理，将5％TNBS与无水乙醇以体积比2∶1配成混合液，按每只大鼠0.1 m L/100 g对模型组进行直肠灌注［2］，对照组给予等体积的PBS。灌注后，正常进食饮水。

1.2.2 取材：分别于建模后第0、3、7、14、21、28天取结肠组织，一部分用于固定，进行常规HE染色，一部分用于提取总RNA，进行real-time RT-PCR的检测。

1.2.3 HE染色：将固定12 h以上的结肠组织依次通过酒精梯度脱水、透明、浸蜡、包埋后制作5μm厚的连续切片，然后进行HE染色，镜下观察在不同时期结肠组织的病理变化。

1.2.4 SP、CGRP和 β-actin的引物和探针引物设计：根据 GenBank中大鼠SP、CGRP和β-actin的基因序列设计引物，详见表1。引物均由上海生物工程技术有限公司和成。

1.2.5 大鼠 SP、CGRP和 β-actin的克隆：按照Trizol使用说明提取大鼠结肠组织总 RNA.以各基因特异性引物进行反转录和PCR扩增，其中反转录体系为20μL，根据说明书进行加样。总RNA 2 μL，Oligo-dT Primer（10μmol/L）1.0μL，DEPC H2O 9.5μL，5×buffer 4.0μL，dNTPm ixture（2.5 mmol/L）2.0μL，reverse transcriptase（5 U/μL） 1.0μL，RNase inhibitor（40 U/μL）0.5μL.混匀后置于42℃水浴90 min，90℃水浴5 min，冰浴冷却备用。PCR扩增反应体系25μL，具体参考说明书进行加样。H2O 17.5μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPm ixture（2.5 mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，反转录产物1μL，Ex Taq（5 U/μL）0.1μL。反应条件为：95℃预变性3 m in；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸5 m in。并将获得的基因片段连接至pMD18-T，进行PCR鉴定及测序。

表1 大鼠SP、CGRP和β-actin引物和探针序列Tab.1 Primers and probe sequence of SP，CGRP andβ-actin of the rats

1.2.6 SP、CGRP和 β-actin mRNA水平的定量检测：对鉴定正确的GAPDH和IL-6质粒重新转化扩增，提取质粒，进行梯度稀释，制作 real-time PCR标准曲线。反应体系为：反转录产物1μL，Taqman real-time PCR master mix 12.5μL，上下游引物及探针各1μL，H2O 8.5μL，反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸5 min。将备好的结肠cDNA样品分别进行real time PCR检测。用建立的荧光定量PCR测定，并绘制出标准曲线给出标准曲线的表达式。他们分别为：β-actin：y=-3.174230x+ 32.527992，R2=0.999347；SP：y=-4.440373x+ 30.221874，R2=0.999013；CGRP：y=-4.383040x +29.985718，R2=0.99922。实验结果采用相对定量即SP或CGRP初始浓度/GAPDH初始浓度表示，根据样品荧光定量扩增曲线和SPSS13.0软件分析，得出IBD发生不同时期，SP和CGRP mRNA在IBD大鼠结肠组织中的表达变化.

图3 A，结肠组织的总RNA电泳图；B、C分别为β-actin，CGRP和SP的扩增和质粒鉴定结果Fig.3 A.Total RNA of the colon tissue；B，C.Amplification and identification ofβ-actin，CGRP and SP genes，respectively

1.2.7 统计学方法：各组数据结果以mean±SD表示。统计用SPSS13.0软件包，实验结果进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 结肠大体、显微病理学变化

动物于造模后24 h即出现懒动，采食量明显减少，体重较对照组明显降低。黄色稀便，肛门周围被毛被稀便沾染，最长时可达两周，有4只大鼠分别在灌肠后3～8日死亡。

在造模后第3、7天处死大鼠剖检发现，整个结肠重量明显增加，肠壁增厚、肠黏膜充血、水肿、糜烂、有溃疡灶，有些大鼠在肠壁损伤部位有假膜样物质覆盖，而且第7天最为严重（图1A～F）。镜下观察发现（图2A～F），灌药后第3天肠绒毛出现脱落，出血和水肿，肠腔内含有大量的坏死组织，肠腔扩张，肠腺减少；第7天肠上皮坏死、脱落，黏膜层和固有层出现了大量炎性细胞和严重的水肿现象；第14天可以看到水肿和出血开始逐渐消退，肠腺开始新生，肠黏膜结构开始形成；第21天，肠上皮的杯状细胞和隐窝开始新生，而且还可以看出肠黏膜上皮是在坏死组织的基础上开始新生的；第28天出血和水肿完全消失，黏膜肌层结构致密，在肠黏膜上有大量的杯状细胞、发达的肠腺和隐窝形成（图1，2见彩插7）。

2.2 SP、CGRP和β-actin基因重组质粒构建

成功提取大鼠结肠组织的总RNA，电泳后可清晰看到28S、18S、5.8S三个条带（图3A）。以总RNA为模板，SP、CGRP和β-actin基因的特异性引物进行反转录和PCR扩增，分别获得了117、140、147 bp的基因片段，与预期目的片段大小一致（图3B）。分别将PCR产物连接转化，提取质粒，并进行质粒的PCR鉴定（图3C）。

2.3 样品荧光定量PCR

通过Real-time RT-PCR方法检测了SP、CGRP mRNA在IBD大鼠不同时期结肠组织中的表达变化（图4）。SP和CGRP的mRNA水平在建模后逐渐升高，直到第7天达到最大值，然后随着疾病的恢复而逐渐降低。

图4 CGRP和SP在IBD大鼠结肠组织中的表达变化（＊＊表示P＜0.01，差异极其显著，*表示P＜0.05，差异显著）Fig.4 Expression of CGRP and SP in the colonof IBD rats.（*P＜0.05，＊＊P＜0.01）

3 讨论

IBD是一种在我国及欧美等诸多国家极为普遍的慢性胃肠道疾病，以肠道炎症和肠黏膜损伤为主要特征，但至今其发病机制尚未阐明，目前认为它是一种自身免疫性疾病，与遗传、免疫、环境及黏膜屏障密切相关［1］。其中免疫因素在IBD发生发展中起着至关重要的作用。而神经肽作为一种神经调质，不仅在神经信息的传导中起重要作用，也是炎症反应时激活神经-免疫系统“对话”，诱发机体连锁免疫反应的重要介质［3］。

SP是一种发现最早、广泛分布于中枢和外周神经系统的具有多种生物活性的神经肽（11肽）。外周组织器官内的SP主要来源于器官内辣椒素敏感神经末稍，但大量实验已经证实SP也可由淋巴细胞［4］、嗜酸粒细胞［5］、肥大细胞［6］和单核巨噬细胞［7］合成分泌，且这类细胞表面还存在着SP的特异性受体NK1R。其生理作用为强烈促进消化系统平滑肌收缩，刺激小肠、结肠黏膜分泌水和电解质等。而降钙素基因相关肽（CGRP）是一种存在于感觉神经末梢的神经肽，由37个氨基酸组成，广泛分布于中枢和外周神经系统，在消化道中也大量存在。CGRP免疫反应神经纤维在肠肌层神经丛有大量分布，在血管周围、黏膜、黏膜下层也有一些，在肌层中几乎没有。它可以对巨噬细胞、淋巴细胞及其它免疫细胞发挥免疫调节作用，通过抑制T细胞的增殖来降低巨噬细胞抗原提呈和活化淋巴细胞的功能［8］。比如，它可促进单核细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子［9］，也可促进SP从初级传入纤维末稍释放并抑制中性内肽酶对SP的降解［10］。释放出的SP可促进肥大细胞脱颗粒释放组胺、激肽、趋化因子、前列腺素、白三烯、IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ等大量炎症介质，可延缓中性粒细胞凋亡［11］，促进中性粒细胞黏附和移行［12］，促进内皮细胞产生黏附分子［13］，促进肥大细胞表达TNF-α mRNA和分泌TNF-α［14］。

在本实验中，我们通过采用TNBS化学诱导建立IBD大鼠模型，采用real-time RT-PCR技术分别检测了CGRP和SP于不同时期的mRNA水平，发现二者在结肠组织中的表达量均与疾病的发展程度呈正相关。与对照组比较，模型组结肠组织中的SP和CGRP均随着疾病的发展而逐渐升高，直到第7天达到最大值，随后逐渐减低，直到28 d接近于正常水平。已有研究发现，溃疡性结肠炎（UC）病人结肠黏膜SP含量明显高于正常人，且结肠中P物质神经纤维比正常人神经纤维线密度明显增高，UC中肠道SP的升高与疾病的严重程度也是呈正相关的，亦即SP的水平可以间接反映疾病的严重程度［15，16］。近年来随着对SP受体NKR研究的深入，发现NK-1R在UC病人结肠中的分布与正常人没有明显差异，都是分布在固有层单核细胞、上皮细胞、黏膜下血管平滑肌以及肠肌丛，但是UC病人结肠中NK-1R的含量却明显高于正常人［17-19］。Goode等［19］测得UC病人结肠组织中NK-1R的mRNA和蛋白质表达水平也都显著高于正常结肠组织，推测过高的NK-1R表达于UC的发病有着重要关系。Lam rani A等［20］使用NK-1R拮抗剂用于由硫酸葡聚糖诱导的实验性结肠炎，发现能够很好地降低实验性结肠性的肠道炎症反应，NK-1R拮抗剂能够降低能够降低疾病活动指数，降低MPO活性，他们发现NK-1R拮抗剂能够减轻肠道氧化应激，推测其与改善肠道炎症有关，但具体作用机制还不是很清楚。Ioana等［21］将NK-1R拮抗剂LY303870用于由T细胞受体缺陷鼠IBD模型上，发现同样能够很好的改善肠道炎症反应。此外，Stucchi等［22］还发现SP参与了UC病人的隐窝炎，使用NK-1R拮抗剂后能明显改善其临床症状，同时降低组织髓过氧化物酶（MPO）活性，暗示NK-1R拮抗剂对隐窝炎有着一定的治疗价值，并有学者指出，在炎症反应调节中SP受体可能是一个潜在的治疗目标［23］。但也有研究者［19］发现，在严重UC患者肠道中SP含量是下降的，同时指出其机制可能与血管活性肠肽下降机制相类似，与在疾病严重期造成的黏膜神经受到很大破坏有关。

同样，我们发现结肠中CGRP mRNA水平与大鼠IBD发病程度呈正相关。众所周知，IBD是一种自身免疫性疾病，体内稳态失衡就会导致该疾病的发生。因此，当IBD发生时，免疫失衡，同样起着免疫调节作用的SP水平显著升高时，相应的CGRP也会随着升高，使二者呈现平衡状态。已有学者发现通过辣椒辣素、热、酸诱导小鼠之后发现结肠中CGRP释放量显著增加［24，25］。因此我们可以推断，在IBD的发生发展过程中，CGRP起着重要的免疫调节作用，同时促进SP的释放［9-14］。从而促进相应的免疫细胞释放大量的炎症介质，使机体产生炎症反应［25］。但也有学者在先后使用CGRP阻断剂和CGRP抗体分别抑制内源性和外源性CGRP后，发现UC模型的炎症症状明显加重，由此推断感觉性神经肽CGRP在UC中通过介导感觉神经的保护效应而减轻结肠黏膜炎症反应［26］。

本实验中，模型组大鼠结肠SP和CGRP表达均较对照组显著增加。已有学者证明在实验性慢性结肠炎症大鼠脊髓中Fos、SP、CGRP表达均显著增多［27］，这也就揭示了模型炎症可能与外周初级传入神经元的损伤有关，而可能的机制是炎症、化学物质的刺激激活内脏感受器，导致从肠道传入脊髓的伤害性信号增多，通过释放SP和CGRP等神经递质作用于相应的受体，从而导致疾病炎症的加重。因此，我们可以推断神经递质SP和CGRP在IBD的发生发展过程发挥了重要的作用。

［1］邓长生，夏冰.炎症性肠病（第2版）［M］.北京：人民卫生出版社.2006：58-73.

［2］张雪莉.电刺激疑核对炎症性肠病大鼠IL-2、IFN-γ表达的影响［D］.吉林大学，2008：19-27.

［3］张建文.结扎冠状动脉诱发SP和CGRP在大鼠心肌组织内的变化及其吗啡、曲马多干预效应的研究［J］.山西医科大学，2005，42-45.

［4］Lai JP，Douglas SD，Ho WZ.Human lymphocytes express substance P and its receptor［J］.J Neuroimmunol，1998，86 （1）：80-86.

［5］Metwali A，Blum AM，Ferraris L，et al.Eosinophils within the healthy or inflamed human intestine produce substance P and vasoactive intestinal peptide［J］.JNeuroimmunol，1994，52：69 -78.

［6］Toyoda M，Makino T，Kagoura M，et al.Immunolocalization of substance P in human skin mast cells［J］.Arch Dermatol Res，2000，292（8）：418-421.

［7］Ho WZ，Lai JP，Zhu XH，Uvaydova M，et al.Human monocytes and macrophages express substance P and neurokinin-1 receptor［J］.J Immunol，1997，159（11）：5654-5660.

［8］李继锋，王舟，纪祥瑞.降钙素基因相关肽在神经免疫内分泌网络中的作用［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2004，1（3）：177-179.

［9］Cuesta MC，Quintero L，Pons H，et al.Substance P and calcitonin gene-related peptide increase IL-1 beta，IL-6 and TNF alpha secretion from human peripheral blood mononuclear cells［J］.Neurochem Int，2002，40：301-306.

［10］Ballet S，Aubel B，Mauborgne A，et al.The novel analgesic，cizolirtine，inhibits the spinal release of substance P and CGRP in rats［J］.JNeuropharmacol，2001，40（4）：578-589.

［11］Bockmann S，Seep J，Jonas L，et al.Delay of neutrophil apoptosis by the neuropeptide SubstanceP：involvement of caspase cascade［J］.Peptides，2001，22：661-670.

［12］Kahler CM，Pischel A，Kaufmann G，et al.Influence of neuropeptides on neutrophil adhesion and transmigration through a lung fibroblast barrier in vitro［J］.Exp Lung Res，2001，27：25-46.

［13］Lindsey KQ，Caughman SM，Olerud JE，et al.Neural regulation of endothelial cell-mediated inflammation［J］.J Investig Dermatol Symp Proc，2000，5：74-78.

［14］Cocchiara R，Lampiasi N，Albeggiani G，et al.Mast cell production of TNF-alpha induced by substance P evidence for a modulatory role ofsubstanceP-antagonists ［J］.J Neuroimmunol.1999，101：128-136.

［15］Watanabe T，Kubota Y，Muto T.Substance P containing nerve fibers in rectal mucosa of ulcerative colitis［J］.Dis Colon Rectum，1997，40（6）：718-725.

［16］Watanabe T，Kubota Y，Muto T.Substance P containing nerve fibers in ulcerative colitis［J］.Int J Colorect Dis，1998，13 （2）：61-67.

［17］Törnblom H，Lindberg G，Nyberg B，et al.Full-thickness biopsy of the jejunum reveals inflammation and enteric neuropathy in irritable bowel syndrome［J］.Gastroenterology，2002，123：1972-1979.

［18］Vento P，Kiviluoto T，Keränen U，et al.Quantitative comparison of growth-associated protein-43 and substance P in ulcerative colitis［J］.JHistochem Cytochem，2001，49：749-758.

［19］Goode T，O＇Connell J，Anton P，et al.Neurokinin-1 receptor expression in inflammatory bowel disease：molecular quantitation and localisation［J］.Gut，2000，47（3）：387-396.

［20］Lam rani A，Tulliez M，Chauvelot-Moachon L，et al.Effects of octreotide treatment on early TNF2 production and localization in experimental chronic colitis［J］.A liment Pharmacol Ther，1999，13（5）：583-594.

［21］Sonea I M，Palmer MV，Akili D，et al.Treatment with neurokinin-1 receptor antagonist reduces severity of inflammatory bowel disease induced by cryptosporidium parvum［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2002，9（2）：333-340.

［22］Stucchi AF，Shebani KO，Leeman SE，et al.A neurokinin-1 receptor antagonist reduces an ongoing ileal pouch inflammation and the response to a subsequent inflammatory stimulus［J］.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2003，285（6）：1259 -1267.

［23］Terbeek WP，Biemond I，Muller ES，et al.Substance P receptor expression in patients with inflammatory bowel disease［J］.Neuropeptides，2007，41：301-306.

［24］Roza C，Reeh PW.Substance P，calcitonin gene related peptide and PGE coreleased from themouse colon：a new model to study nociceptive and inflammatory responses in viscera，in vitro［J］.Pain，2001，93：213-219.

［25］Evangelista S，Tramontana M.Involvement of calcitonin gene related peptide in rat experimental colitis［J］.J Physiol Paris，1993，87（4）：277-280.

［26］Reinshagen M，Flamig G，Ernst S，et al.Calcitonin gene related peptidemediates the protective effect of sensory nerves in amodel of colonic injury［J］.J Pharmacol Exp Ther，1998，286（2）：657-661.

［27］郑雪雁.实验性慢性结肠炎症大鼠的内脏感觉变化及帕罗西汀的影响［D］.福建医科大学，2007：27-28.