重症甲型H1N1流感患者外周血T淋巴细胞亚群变化的临床意义探讨

陈颖，王军，温华，代兵，孙龙凤，谭伟，康健，赵洪文

（中国医科大学附属第一医院呼吸内科，沈阳 110001）

重症甲型H1N1流感患者外周血T淋巴细胞亚群变化的临床意义探讨

陈颖，王军，温华，代兵，孙龙凤，谭伟，康健，赵洪文

（中国医科大学附属第一医院呼吸内科，沈阳 110001）

目的探讨甲型H1N1流感（甲流）患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及临床意义。方法 采用流式细胞仪对70例甲流患者，19例普通流感患者，31例健康体检者的外周血T淋巴细胞亚群进行检测。70例甲流患者中，男51例，女19例，年龄19～66岁。其中重症24例，危重症46例（死亡8例）。结果 普通流感患者外周血T淋巴细胞亚群与健康对照组无差别，但甲流患者外周血CD3、CD4、CD8T淋巴数均明显低于健康对照组和普通流感组（P均＜0.05）；危重症甲流患者外周血CD3、CD4、CD8T淋巴数均分别明显低于重症甲流患者（P均＜0.01）；死亡患者外周血CD3、CD4、CD8T淋巴数均明显低于存活患者（P均＜0.01），而且死亡患者CD3和CD4均小于正常低值；各组间CD4/CD8变化无显著差别；甲流患者和健康对照者血中免疫球蛋白水平无差别。结论甲型H1N1流感病毒可能损伤细胞免疫，尤其是T细胞免疫，但未损伤体液免疫。外周血T淋巴细胞亚群数量减少可能是病情严重性和疾病转归及预后的一个重要指标，而且早期检测对甲流与普通流感的鉴别可能有重要意义。

甲型H1N1流感；T淋巴细胞亚群；细胞免疫

2009年3 月以来，甲型H1N1流感（甲流）爆发并迅速在全球蔓延，我国也出现了大量的感染病例，且死亡病例迅速增加。由于本次甲型H1N1流感病毒是一种新型流感病毒，因此，许多临床特点尚不清楚。为了观察甲流患者免疫状态的变化及其意义，本研究对70例重症/危重症甲流住院患者外周血T淋巴细胞亚群进行了检测，动态观察其变化，并与同期健康体检者及普通流感患者进行比较，以期发现重症/危重症甲流的某些特点，为临床诊断、治疗和估计预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例来源及分组

将研究对象分为：（1）甲型H1N1流感组（n=70）：2009年11月5日至2010年1月13日期间我院收治的经咽拭子PCR检测阳性的临床确诊病例。男51例，女19例，平均年龄43岁（19～66岁）。其中入院时重症甲流患者24例，危重症甲流患者46例（死亡8例）。重症和危重症的诊断标准参见卫生部发布的《甲型H1N1流感诊疗方案（2009年第三版）》［1］；（2）普通流感组（n=19）：同期我院发热门诊普通流感患者；（3）健康对照组（n=31）：同期健康体检者。

1.2 方法

1.2.2 实验方法：（1）标本处理：抽取患者外周血2ml，用肝素钠抗凝管保存，6h内分析。向TrueCount管内分别加入20μl的抗体和50μl的抗凝全血，振荡混匀3s，避光放置15min；加入1倍浓度的溶血素450μl，振荡混匀后避光放置15min，然后进行数据分析。（2）数据获取与分析：使用CaliBRITE标准微球、FACSComp软件调节FACS Calibur流式细胞仪PMT电压、荧光补偿、灵敏度，应用MultiSet分析软件对处理好的标本进行、绝对值计数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 外周血白细胞总、分数的比较

对所有住院甲流患者于入院次日晨抽外周血作血常规，并与健康对照组和同期我院发热门诊普通流感患者进行比较，结果见表1、表2。

表1各组研究对象的外周血白细胞总、分数T a b.1P e r i p h e r a l WB Cc o u n t s a n d d i f f e r e n t i a l c o u n t s o f t h e s u b j e c t s i n e a c h g r o u p Group n WBC counts（×109/L） GRAN counts（×109/L） Lymphocyte counts（×109/L） NEUT（%） LYMPH（%）Normal subjects 31 6.20±1.39 3.62±1.18 2.06±0.68 85.55±15.35 32.63±10.56Seasonal influenza 19 6.48±3.10 4.67±2.54 1.62±1.10 87.67±7.40 22.65±8.401）Pandemic influenza 70 9.13±5.102） 7.42±5.102） 1.21±0.672） 76.29±15.352） 17.24±13.262）Severe cases 24 7.37±4.49 5.40±4.12 1.39±0.63 68.89±15.097 21.50±12.76Critical cases 46 10.05±5.213） 8.48±5.283） 1.12±0.68 80.01±14.333） 14.31±12.883）Survivals 62 8.67±6.54 6.19±3.68 1.26±0.67 73.98±14.10 18.88±13.21Deaths 8 18.28±4.874） 17.02±4.414） 0.88±0.57 93.38±2.824） 4.56±2.154）WBC，white blood cell；GRAN，granulocyte；NEUT，neutrophil；LYMPH，lymphocyte.1）P ＜ 0.05vs normal subjects；2）P ＜ 0.05vs normal subjects and seasonal influenza；3）P ＜ 0.05vs severe cases；4）P ＜ 0.05vs survivals.表2不同病情和转归的甲流患者外周血白细胞总数和淋巴细胞计数T a b.2P e r i p h e r a l b l o o d WB Cc o u n t s a n d l y mp h o c y t e c o u n t s o f t h e H 1N 1p a t i e n t s w i t h d i f f e r e n t c o n d i t i o n a n d o u t c o me s Group n WBC counts>10×109/L（n/%） Lymphocyte counts<0.8×109/L（n/%）Pandemic influenza 70 22（31.4） 22（31.4）Severe cases 24 2（8.3） 6（25.0）Critical cases 46 20（43.4） 16（34.8）Survivals 62 14（22.6） 17（27.4）Deaths 8 8（100.0） 5（62.5）WBC，white blood cells.

结果显示，除淋巴细胞比例降低外，普通流感患者较健康对照组白细胞总数、淋巴细胞计数、粒细胞计数均未见明显异常。然而，甲流患者较正常人及普通流感患者的淋巴细胞计数和淋巴细胞比例明显降低，同时白细胞计数及粒细胞计数明显升高，其中白细胞总数>10×109/L的甲流患者和淋巴细胞计数<0.8×109/L的甲流患者均占31.4%。将危重症与重症甲流相比较发现，危重症甲流患者的白细胞总数和粒细胞计数高于重症患者，而淋巴细胞计数和比例低于重症患者（危重症和重症患者细胞总数>10×109/L者分别占43.8%和8.3%，淋巴细胞计数<0.8×109/L分别占34.8%和25.0%），而且死亡患者白细胞总数和粒细胞计数较存活甲流患者明显升高，但淋巴细胞计数和比例明显降低（死亡患者和存活患者细胞总数>10×109/L者分别占100%和22.6%，淋巴细胞计数<0.8×109/L分别占62.5%和27.4%）。

2.2 各组外周血T淋巴细胞亚群的变化

对所有住院甲流患者入院次日晨抽外周血作T淋巴细胞亚群的检测，并与健康对照组和同期我院发热门诊普通流感患者进行比较，结果见表3、表4。

表3各组外周血T淋巴细胞亚群检测结果比较（个/μl）T a b.3C o mp a r i s o n o f p e r i p h e r a l Tl y mp h o c y t e s u b s e t s o f t h e s u b j e c t s i n e a c h g r o u p Group n CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 Normal subjects 31 1322±493 727±258 550±256 1.45±0.52Seasonal influenza 19 1320±553 730±321 518±298 1.82±1.60Pandemic influenza 70 865±6501） 509±4031） 346±2591） 1.60±0.86Severe cases 24 1205±598 696±399 453±257 1.68±0.93Critical cases 46 687±6102） 412±3732） 290±2452） 1.55±0.82Survivals 62 971±638 554±406 375±260 1.61±0.89Deaths 8 291±1953） 165±1163） 116±823） 1.50±0.541）P＜0.05vs normal subjects and seasonal influenza；2）P＜ 0.01vs severe cases；3）P＜ 0.01vs survivals.表4不同病情和转归的甲流患者外周血淋巴细胞亚群低于正常低值的患者比例T a b.4T h e n u mb e r s o f H 1N 1p a t i e n t s w i t h p e r i p h e r a l b l o o d l y mp h o c y t e s u b s e t s b e l o wn o r ma l l o w e r l i mi t GroupnCD3<700/μl（n/%）CD4<400/μl（n/%）CD8<200/μl（n/%）Pandemic influenza 70 36（51.4） 36（51.4） 26（37.1）Severe cases 24 5（20.8） 6（25.0） 4（16.7）Critical cases 46 31（67.4） 30（65.2） 22（47.8）Survivals 62 28（45.2） 28（45.2） 19（30.6）Deaths 8 8（100.0） 8（100.0） 7（87.5）

与健康对照组比较，普通流感患者外周血T淋巴细胞亚群未见降低，但甲流患者外周血的CD3、CD4、CD8均分别较健康对照组和普通流感组明显降低（甲流患者外周血 CD3、CD4、CD8低于正常低值者分别占51.4%，51.4%和37.1%），而且随着疾病严重性的加重其减低越明显（表3）。将重症甲流和危重症甲流进行比较发现，危重症甲流患者外周血CD3、CD4、CD8均分别明显低于重症甲流患者（P均＜0.01）。然而各组间CD4/CD8变化无显著差别。将死亡患者与存活患者的外周血CD3、CD4、CD8进一步比较发现，死亡患者均明显低于存活患者，而且死亡患者CD3和CD4均小于正常低值（表4）。

2.3 急性期与恢复期甲流患者外周血T淋巴细胞亚群的动态变化

在70例甲流患者中，我们对20例患者进行了外周血T淋巴细胞亚群的动态检测，将急性期（入院时）与恢复期（出院时）外周血T淋巴细胞亚群进行比较发现，恢复期CD3、CD4、CD8［（1468±644）个/μl、（818± 375）个/μl、（594± 337）个/μl］比急性期 CD3［（470± 250）个/μl、（241± 147）个/μl、（200± 109）个/μl］明显升高（P<0.01），基本恢复至正常水平。然而恢复期CD4/CD8（1.54±0.58）与急性期（1.31±0.56）相比无统计学差别。

2.4 甲流患者和健康对照者血中免疫球蛋白的变化

为了探索甲型H1N1流感病毒在损伤细胞免疫的同时是否也损伤体液免疫，我们对39例甲流患者及31例健康体检者进行了免疫球蛋白水平的检测，结果发现，甲流患者 IgA 、IgG 及 IgM［（2.235±1.04）g/L，（14.28±4.19）g/L，（1.2±0.6）g/L］与健康体检者［（2.126±0.96）g/L，（12.84±3.23）g/L，（1.5±0.5）g/L］比较，未见统计学差异（P>0.05）。

3 讨论

2009年3 月以来爆发的甲型H1N1流感，是由一种以前未在人体内发现过的A/H1N1流感病毒引起的急性热性呼吸道传染病［2］。研究表明，这种新型流感病毒基因组由禽流感、猪流感和人流感病毒基因混合而成，既有甲型流感病毒的共性，也有其特殊性［3］。甲型H1N1流感与季节性普通流感在致病性上有两方面不同，一是大多数人仅有很弱或完全没有对此病毒的既往获得性免疫，二是这种病毒能够累及下呼吸道并迅速引起进行性肺炎［4］。

构成机体免疫系统的淋巴细胞主要有T、B淋巴细胞，机体对抗病毒感染主要是特异性T淋巴细胞免疫反应［5，6］。人体免疫内环境的稳定是由T淋巴细胞各亚群的比例来进行调节和维持的。因此甲流患者外周血T淋巴细胞亚群的研究对临床诊断、治疗和估计预后具有重要的临床意义。本研究发现，与健康对照组比较，普通流感患者外周血T淋巴细胞亚群未见降低，说明普通流感病毒对淋巴细胞亚群的损伤不明显。但甲流患者外周血的CD3、CD4、CD8T淋巴细胞均较健康对照组和普通流感组明显降低，而且随着疾病严重性的加重其减低逐渐明显。提示早期检测外周血T淋巴细胞亚群对甲流与普通流感的鉴别可能有重要意义，亦提示甲流患者外周血T淋巴细胞亚群可能是病情严重性的一个重要指标。将死亡患者与存活患者的外周血CD3、CD4、CD8T淋巴细胞数进一步比较发现，死亡患者均明显低于存活患者，而且死亡患者CD3和CD4均小于正常低值，提示甲流患者外周血T淋巴细胞亚群可能是估计预后的一个重要指标。我们对20例甲流患者的急性期和恢复期的外周血T淋巴细胞亚群的动态检测结果对比发现，恢复期CD3、CD4、CD8比急性期均明显升高，且基本恢复至正常水平。也提示外周血T淋巴细胞亚群的变化对估计病情的转归和预后具有重要的作用。但比较甲流患者与正常人的免疫球蛋白水平结果发现，甲流患者较正常人的IgA、IgG及 IgM未见明显降低（P>0.05），这表明甲流病毒可能只损伤细胞免疫，而未损伤体液免疫。

本研究发现，普通流感患者较健康者除淋巴细胞比例降低外，余未见明显异常，说明普通流感病毒对淋巴细胞仅有轻微损害。然而，甲流患者较正常人及普通流感患者的淋巴细胞计数和淋巴细胞比例明显降低，同时白细胞计数及粒细胞计数明显升高；将危重症与重症甲流比较发现，危重症甲流患者的白细胞总数和粒细胞计数明显高于重症患者，而淋巴细胞计数和比例明显低于重症患者，而且死亡与存活甲流患者比较结果显示，白细胞总数和粒细胞计数明显升高，而淋巴细胞计数和比例明显降低。表明甲流病毒较普通流感病毒更易损伤淋巴细胞，其变化趋势与T淋巴细胞亚群的变化趋势相一致；而白细胞计数及粒细胞计数明显升高可能是由于细胞免疫的损伤继发细菌感染所致。本组中8例死亡患者均合并继发感染，其中2例血培养为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌败血症，2例血培养为鲍曼不动败血症。国外研究也证明甲型H1N1流感易合并细菌性感染，尤其在重症甲流的早期，病原菌以肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌最常见［7］。本结果提示甲流病毒损伤细胞免疫越重，越易引起细菌感染，外周血白细胞总数和分类的变化可能对判断疾病的严重性和预后也具有一定的作用。

总之，本研究表明，甲型H1N1流感病毒可能只损伤细胞免疫，尤其是T细胞免疫，但未损伤体液免疫。而且，细胞免疫损伤越重，越易引起细菌感染，预后越差。因此，甲流患者外周血T淋巴细胞亚群可能是病情严重性和疾病转归与预后的一个重要指标，早期检测外周血T淋巴细胞亚群对甲流与普通流感的鉴别可能也有着重要的临床意义，而外周血白细胞总数和分类的变化可能对判断疾病的严重性和预后具有一定的作用。

［1］卫生部办公厅.甲型H1N1流感诊疗方案（2009年第三版）［Z］.北京，2009.

［2］王新华，刘宇，周荣斌.甲型H1N1流感的研究现状［J］.山东医药，2009，49（2）：107-108.

［3］李刚.甲型H1N1流感病毒的分子特征［J］.首都医科大学学报，2009，30（3）：267-270.

［4］Clinical management of human infection with pandemic influenza（H1N1）2009：Revised guidance.World Health Organization，November，2009.

［5］Dunne PJ，Faint JM，Gudgeon NH，et al.Epstein-Barr virus-specific CD8（+）T cells that re-express CD45RA are apoptosis-resistant memory cells that retain replicative potential ［J］.Blood，2002，100（3）：933-940.

［6］Wills MR，Okecha G，Weekes MP，et al.Identification of naive or antigen-experienced human CD8（+）T cells by expression of costimulation and chemokinereceptors：analysisofthe human cytomegalovirus-specific CD8（+）T cell response ［J］.J Immunol，2002，168（11）：5455-5464.

［7］Centers for Disease Control and Prevention （CDC）.Bacterial coinfections in lung tissue specimens from fatal cases of 2009pandemic influenza A （H1N1）-United States，May-August 2009［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009，58（38）：1071-1074.

（编辑王又冬，英文编辑王又冬）

Clinical Significance of Peripheral Blood T-lymphocyte Subsets Changes in Pandemic Influenza （H1N1） Patients

CHEN Ying，WANG Jun，WEN Hua，DAI Bing，SUN Long-feng，TAN Wei，KANG Jian，ZHAO Hong-wen
（Department of Respiratory Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the change of peripheral blood T-lymphocyte subsets in pandemic influenza （H1N1）and its clinical significance.MethodsThe subsets of peripheral blood T-lymphocyte in 70patients with pandemic influenza（H1N1），19patients with seasonal influenza and 31normal subjects were detected by flow cytometry.The patients with pandemic influenza（H1N1）comprised of 51male and 19female aged 19to 66years，including 24severe cases and 46critical cases.ResultsThere was no significant difference in the numbers of peripheral blood T-lymphocyte subsets between the patients with seasonal influenza and normal subjects.However，the numbers of CD3，CD4and CD8lymphocytes significantly decreased in patients with pandemic influenza（H1N1）compared with those in seasonal influenza and normal subjects（P<0.05），especially in critical patients（P<0.01）.The counts in non-survivors decreased significantly compared with those in survivors（P<0.01），and both the counts of CD4and CD8in non-survivors were less than the normal lower limit.There was no significant change in CD4/CD8ratio among the three groups.IgA，IgM and IgG were not distinctive between the pandemic influenza（H1N1）patients and the normal subjects.ConclusionPandemic influenza （H1N1）might impair the cellular immunity，especially T-lymphocyte immunity，but not humoral immunity.The subsets of peripheral blood T lymphocyte might be an important index for the severity and prognosis of the disease.Early detection on them might have important significance for distinguishing pandemic influenza（H1N1）from seasonal influenza.

pandemic influenza（H1N1）；T-lymphocyte subsets；cellular immunity

R563.8

A

0258-4646（2011）02-0140-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0952.010

辽宁省医学高峰建设工程重点科研项目（200922）

陈颖（1982-），女，医师，本科.

赵洪文，E-mail：hwzhao2007@yahoo.com

2010-09-30