小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

袁 伟，董 娜，张丽芳，林树柱，向志光，乔红伟，秦 川

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病。据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌。随着多重耐药菌、极度耐药株的出现，艾滋病与结核共感染人群的增加使得活动性结核病人日益增多［1］。卡介苗（BCG）用于预防结核病已有80多年的历史，在世届卫生组织免疫接种扩大方案中，卡介苗作为目前唯一的结核病疫苗正在广泛使用。它虽然可以极好地预防幼儿粟粒性结核和结核脑膜炎，但不能预防结核病的最流行形式——成人肺结核，因此研究更为有效的 TB新型疫苗对TB的防治有着重要的意义。随着MTB基因组测序的完成和比较基因组学的研究进展，人们通过基因工程技术改造BCG，或研究亚单位疫苗、基因疫苗、载体活疫苗等新型疫苗，或与BCG联合建立组合型疫苗，采用基础-加强型免疫策略等，以解决BCG的免疫力不足，以及其对成人保护性差和缺乏清除潜伏菌等问题。

有效、特异的保护性抗原是疫苗成功的一个重要因素，近年来，随着基因组学研究的进展，不断的有新抗原被发现和鉴定，目前，研究较多的结核杆菌保护性抗原有M tb8.4、M tb32、TB10.4、MPT64和38kD蛋白（PstS-1）等，国际上正在进行临床研究的结核病疫苗采用的抗原主要是 Ag85、ESAT-6和M tb72F等。HspX是一种相对分子质量为16000的小分子热休克蛋白家族，由基因 hspx（rv2031c）表达，属于结核菌休眠期调控子（DosR regulon）。HspX是结核分枝杆菌在静止生长期或低氧状态下产生的主要蛋白，有研究表明HspX在结核分枝杆菌感染后短时间内减缓其在体内生长速度方面可能起到某种关键作用［2］。本研究选择了结核重要的保护性抗原Ag85B和ESAT-6，以及休眠期细菌特有的抗原HspX，构建了 Ag85B-Esat6-HspX重组质粒，并将其免疫BALB/c小鼠，对其免疫原性了进行评价，进而为此疫苗的效力学评价奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及蛋白

冻干皮内注射用卡介苗（BCG）购于成都生物制品研究所。pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX和pcDNAHspX质粒由本室构建并保存。HspX蛋白由本室纯化、保存。

1.2 主要试剂

去除内毒素（endo free）的质粒抽提试剂盒为Qiagen公司产品（德国）。小鼠干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素2（IL-2）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒为美国 Biolegend公司产品。小鼠预包被ELISPOT试剂盒为深圳达科为生物技术有限公司产品。

1.3 实验动物

BALB/c小鼠（SPF级）购于北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2006-0009］。鼠龄6～8周，体重18～22 g，自由饮食进食，昼夜节律12 h。

1.4 动物分组及免疫

采用随机数字表法将40只小鼠分为4组，每组10只：生理盐水组 （NS，100μL）；BCG组 （1×106CFU/只）；pcDNA-HspX组 （pcDNA-HspX，100μg）、pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX 组 （pcDNA-Ag85BEsat6-HspX，100μg）。

分别在第0、2、4周用质粒DNA一侧股四头肌肌肉注射免疫动物（100μg/只），1×106CFU BCG第0周时在颈部皮内免疫动物1次。在免疫的第2、4周和最后一次免疫后2周，各组小鼠剪取鼠尾取血，分离血清，检测体液免疫指标。动物在最后一次免疫后2周处死，无菌分离脾脏淋巴细胞检测细胞免疫指标。

1.5 ELISA法检测血清特异性抗体

HspX蛋白 100μL/孔（5μg/m L）包被酶标板，4℃过夜。1％牛血清白蛋白封闭30 m in，PBST溶液300μL/well洗板5次×3 m in/次。用PBST溶液1∶500稀释血清样品后，100μL/well加入酶标板，37℃孵育1 h。再次洗板后，加入100μL/well的1∶1000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG，然后加入100μL/well TMB显色液，室温避光反应15 min显色后，加入50μL/well终止液（2 mol/L H2SO4）终止反应，450 nm处检测吸光度（A）值。

1.6 特异性IFN-γ和IL-2的诱导和测定

用含10％FCS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为5×106/m L，800μL/well加入24孔细胞培养板中，同时每孔加入80μL HspX蛋白，置5％CO2孵箱中37℃培养72 h后，收集培养液，5000 rpm离心5 m in，取上清液，-20℃冻存备检。IFN-γ和IL-2含量的检测用ELISA方法，以IFN-γ和IL-2的标准品作标准曲线计算二者的含量。

1.7 EL ISPOT法检测免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ细胞数

IFN-γ的水平与结核病的保护性免疫反应相关，应用ELISPOT方法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞针对特异性抗原分泌IFN-γ的能力。小鼠最后一次免疫2周后无菌分离脾脏，应用ELISPOT技术检测脾细胞受到 HspX蛋白刺激后 IFN-γ的表达。ELISPOT板预先用 IFN-γ抗体包被过夜，无菌摘除脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，经淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。将终浓度为5×106/m L的淋巴细胞100μL/well加入96孔ELISPOT板中，并分别给予HspX蛋白（10μg/m L）刺激，并设阴性对照，加培养基、不加刺激物；阳性对照，用 PMA（1 ng/ m L）刺激，共同孵育24 h后，按ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色，计数斑点数。1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0进行方差分析，将疫苗免疫组结果与生理盐水组进行比较。P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 质粒纯度和含量的测定

抽提的质粒DNA在260 nm处与280 nm处的A值比值均在1.80以上，且经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，并没有发现RNA的污染。

2.2 免疫小鼠血清抗HspX-IgG的测定

图1 免疫小鼠体内诱导的特性性抗体水平（*P＜0.05）Fig.1 Serological responses against special antigen in immunized mice（*indicates P＜0.05）

用HspX抗原刺激后，ELISA法检测总IgG抗体结果显示（见图1），随着免疫时间的增加，免疫小鼠的抗体水平持续增加，DNA免疫小鼠在最后一次免疫后2周的抗体水平最高，融合基因组（即 pAEH组）免疫小鼠血清总IgG OD值均高于其他三组（P＜0.05）。同时，单纯 HspX质粒 DNA免疫组（即pHspX组）与BCG组或生理盐水组相比，也产生了较高水平的IgG（P＜0.05），表明潜伏期抗原能诱导较强的体液免疫反应。

2.3 免疫小鼠脾淋巴细胞特异性 IFN-γ的分泌水平

BCG及各 DNA疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞在体外经过 HspX抗原刺激后，可以引起特异性IFN-γ的分泌，但NS组小鼠IFN-γ分泌不明显（图2）。融合基因组与 BCG组、pHspX免疫组比较，差异有显著性（P＜0.05），表明 pcDNA-Ag85BEsat6-HspX免疫小鼠后产生特异性的 IFN-γ水平最高。

图2 免疫小鼠脾淋巴细胞诱生的IFN-γ水平 （* P＜0.05）Fig.2 The level of IFN-γinduced in splenolymphocytes of the immunized m ice.（* indicates P＜0.05）

2.4 免疫小鼠脾淋巴细胞特异性IL-2的分泌水平

融合基因免疫小鼠后脾淋巴细胞所诱生的IL-2含量也最高，为84.63±8.76 pg/m L，高于 BCG组的 37.65±2.72 pg/m L（P＜0.05）和 pHspX免疫组的42.42 ±3.61pg/m L（P＜0.05）（图3）。

2.5 ELISPOT检测结果

融合基因组经 HspX抗原（10μg/m L）体外刺激后分泌IFN-γ显著升高，与pHspX组或BCG组比较，差异有显著性（P＜0.05）；同时，pHspX组经HspX抗原（10μg/mL）体外刺激后分泌IFN-γ也明显升高，与 NS组比较差异有显著性（P＜0.05）。阳性对照组（PMA刺激）分泌IFN-γ的细胞数目和水平均较高且一致，阴性对照组（不刺激）仅见极少量的IFN-γ分泌（图4）。

图3 免疫小鼠脾淋巴细胞诱生的IL-2水平（* P＜0.05）Fig.3 The level of IL-2 induced in splenolymphocytesof the immunized mice.（* indicates P＜0.05）

3 讨论

DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗。DNA疫苗不仅可引起体液免疫反应，而且能诱导高水平的细胞免疫应答，尤其是细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应，被认为在病毒、细菌、寄生虫等病原体感染的防治中具有更大的优势。DNA疫苗仅由DNA（如质粒）或RNA（如mRNA）组成，疫苗抗原的编码基因插入适当的真核细胞质粒DNA的始动子及终止密码之间，它可在细菌体内复制，而不能在人类宿主细胞内复制。此质粒可由大肠杆菌培养中纯化而得到。DNA被肌肉细胞摄取进入细胞核内，在此抗原基因被转录，mRNA被转运至细胞质内并被翻译为蛋白质，表达特定的抗原，导致免疫反应的产生。

编码单一结核分枝杆菌抗原的DNA疫苗的保护效应一般都不及BCG，提高DNA疫苗效应的方法除继续筛选更为有效的保护性抗原以外，还包括多种单一抗原成分的DNA疫苗的联合免疫，与分子佐剂如细胞因子、共刺激分子等联合使用以及改进免疫接种方式、途径和程序等。Ag85B和Esat6都是结核分枝杆菌的早期培养液分泌蛋白中具有较强免疫保护作用的抗原成分之一，分别含有多个不同T细胞的表位，能诱导机体产生保护性细胞免疫。

抗原85复合体是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白［3］。最早在结核杆菌和BCG的生长期早期培养滤液中发现，在菌体表面也有少量分布。经SDS-PAGE和等电聚焦分析可分为3个组分即Ag85A、B、C，大小分别为31、30、30.5（×103），由3个不同的基因编码。其中有免疫作用的主要为Ag85A和B，Ag85A比Ag85B分泌得多，而 Ag85B在细菌表面分布较多。范雄林等［4］在小鼠模型上将不同结核保护性抗原的 DNA疫苗进行了免疫原性及保护效力的比较，发现Ag85B是比较理想的候选抗原。另外，在感染结核或麻风菌与卡介苗免疫的小鼠及人体上，Ag85复合体不仅可以刺激产生体液免疫，而且可激发较强Th1型细胞免疫，引起CD8+T细胞增殖和IL-2、GMCSF及IFN-γ等细胞因子水平的上升。

EAST6即6KD早期分泌性抗原性蛋白，是从结核杆菌短期培养滤液（ST-CF）中纯化分离出的一种低分子量的分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性。EAST6仅存在于结核杆菌群及少数几种致病性分枝杆菌中，在90％以上的非致病性分枝杆菌中缺乏编码该蛋白的基因（除勘萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌和苏加分枝杆菌外），而且在所有BCG中也均缺乏。ESAT6是免疫记忆效应性 T细胞的主要靶抗原之一，可在再次感染的早期，诱导其迅速增值和释放高水平的 IFN-γ，有效的激活巨噬细胞来控制结核病感染［5］。王清民等［6］对融合泛素的Esat6核酸疫苗进行了研究，发现该 DNA疫苗不仅增强了细胞免疫反应，而且对结核感染提供了很好保护。

随着人们对潜伏感染的认识，休眠期结核杆菌开始受到重视。休眠期结核杆菌为了适应缺氧等恶劣生存环境部分基因表达上调。Leyten EM等［7］用25种 DosR Regulon编码的休眠期抗原进行实验，发现与结核病人相比，健康的结核菌素实验阳性者外周血单个核细（PBMC）能识别更多的休眠期抗原，并产生更强烈的IFN-γ反应。HspX抗原可以被致敏的T细胞识别，刺激T细胞分泌IFN-γ，具有细胞免疫和体液免疫原性。

机体抗TB免疫主要依赖于T细胞及一些相关细胞因子的协助。对MTB的细胞胞免疫应答是以T细胞为介导、以巨噬细胞为效应细胞的免疫反应。有效的抗MTB免疫反应包括巨噬细胞吞噬MTB以及处理与递呈抗原，T淋巴细胞对抗原的特异性识别与结合以及因受刺激而增殖与分化、细胞因子释放、巨噬细胞激活和杀菌等步骤。IL-2通过T淋巴细胞增长因子和激活巨噬细胞释放 IFN-γ消灭MTB，而IFN-γ在机体的抗MTB感染中发挥着重要作用，它可激活单核细胞和巨噬细胞，使其发挥杀菌作用。IFN-γ主要由TB患者体内的 CD4+T细胞、CD8+T细胞及NK细胞产生［8］。

本研究将休眠期抗原与生长早期抗原联合使用，成功构建了能够在真核细胞表达融合蛋白的重组质粒，并将该重组质粒肌肉注射于小鼠，进行免疫学评价。一方面，经过特异性抗原的刺激后，随着免疫时间的延长，免疫小鼠的总IgG抗体水平持续增加，并于最后一次免疫后2周达到高峰。并且在第4周和第6周时，DNA疫苗免疫组OD值均高于BCG组，表明融合基因能够诱导较强烈的体液免疫反应并能保持良好的持久性；另一方面，融合基因免疫小鼠后脾淋巴细胞诱生的 IFN-γ和 IL-2产量也均高于BCG免疫小鼠，表明该融合基因可诱导小鼠产生强烈的细胞免疫应答。同时，诱导T细胞释放IFN-γ的能力通常被用来作为评价候选疫苗是否诱导Th1型细胞免疫反应的关键指标。本研究中ELISPOT检测结果表明，应用 HspX抗原体外刺激后，融合基因组小鼠脾淋巴细胞分泌 IFN-γ的水平最高，说明该融合基因诱导机体产生了较强的细胞免疫反应。

总之，Th1型的细胞免疫应答对控制MTB的感染起着重要的作用，而且IFN-γ和IL-2都是重要的Th1型细胞因子，并已被证明在抗MTB的治疗中具有一定作用［9］。本研究构建的 Ag85B-Esat6-HspX融合基因疫苗，目的就是希望其诱导的免疫向着有利于控制MTB感染的Th1型的应答方向发展，同时也为今后该疫苗的效力学评价提供一些理论和实验依据。

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