鸡致病性大肠杆菌的实验室诊断技术

李现胜

（山东省临朐县畜牧局，临朐 262600）

鸡致病性大肠杆菌的实验室诊断技术

李现胜

（山东省临朐县畜牧局，临朐 262600）

本文介绍了山东潍坊市各鸡场近1年来发生的鸡大肠杆菌病所进行的实验室试验。试验通过收集临朐畜牧局动物门诊临床诊断为大肠杆菌病的鸡只病料作为被检材料，对之进行了分离培养、生化鉴定、动物试验及药敏试验。结果表明，该菌对阿米卡星、氟苯尼考、头孢哌哃、磷霉素钠等药物有较高的敏感性，而对链霉素、四环素、阿莫西林等药物的敏感性较低。

鸡 大肠杆菌 分离 鉴定 药敏试验

鸡大肠杆菌病是由致病性血清型的埃希氏大肠杆菌引起的一类传染病的总称。本病的感染途径很多，主要通过消化道和呼吸道感染，也可通过种蛋垂直传播等，临床上可引起急性败血症、眼炎、心包炎、肝周炎、输卵管炎、气囊炎、关节炎等多种病型。近年来，随着集约化养禽业的迅速发展，在一些养殖密集区广泛流行，个别地方已呈爆发流行的趋势，发病率有时可高达70%左右，死亡率在50%不等，该病已成为困扰养禽业健康发展的主要疾病之一。

本实验通过对细菌的分离培养、生化试验、动物试验、药敏试验等一系列细菌生物学试验，来分析研究本地区养鸡场内常发生的大肠杆菌病，并深入了解其发病机理、病原特性以及预防机制，以便获得更好的临床应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 所有病料均来自于临朐县畜牧局动物门诊日常诊断病例，初步确诊为大肠杆菌病的病鸡68只，其中肉仔鸡、蛋雏鸡41只，育成鸡27只。

1.1.2 培养基与试剂 麦康凯琼脂（NA）、伊红美兰琼脂、普通肉汤、营养琼脂（NA）（均购自上海伯奥生物科技有限公）；硝酸盐还原剂、氧化酶试剂、微量生化试验管、药敏纸片购自（均购自杭州天和微生物试剂有限公司）。

1.1.3 试验动物 各日龄健康鸡（购自山东济南SPF种鸡场）。

1.1.4 仪器及设备 光学显微镜、恒温箱、高压灭菌器、无菌实验台、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌的分离培养 以无菌操作的方法，采取病死鸡的肝、脾、心包液、气囊膜等处病料，划线于麦康凯琼脂上，37 ℃培养24～48 h挑取红色单个菌落划线接种于伊红美蓝琼脂平板，37 ℃培养18～24 h，挑取紫黑色带金属光泽的单个菌落接种于普通肉汤和普通琼脂斜面，37 ℃培养18～24 h，用石蜡胶塞密封，置4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 形态学观察 取伊红美蓝琼脂平板上紫黑色带金属光泽的单个菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察记录菌体形态和染色特征。

1.2.3 生化鉴定 取微量生化管及各种生化培养基，将分离菌纯培养物的菌种接入后封口，置于37℃培养箱中培养18～24 h，观察结果。

1.2.4 致病性试验 将分离到的大肠杆菌接种普通肉汤培养物，37 ℃培养24 h。经测定每毫升肉汤培养物约含1× 109CFU。按每株菌3只（5日龄健康非免疫雏鸡），颈部皮下注射0.2 ml/只。对照组6只颈部皮下注射灭菌肉汤。及时剖检死亡鸡，分离细菌。判定标准：能使试验鸡在24 h内全部死亡或在48 h内死亡2/3以上的菌株作为致病菌株。

1.2.5 药敏试验 将获得的致病菌株的菌液，均匀涂抹于营养琼脂平板，每菌株2板，然后将药敏纸片平均分布，37 ℃培养24 h。

2 结果

2.1 大肠杆菌的分离培养

麦康凯琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径为1.5～2.5 mm的小菌落；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落；在普通琼脂斜面上的菌落为灰白色；在普通肉汤中呈均匀浑浊，管底有灰白色沉淀，并有粪臭味。

2.2 形态学观察

经镜检可见到革兰氏阴性，两端钝圆，长约1.5～3.0μm的短小杆菌，多单在，偶有2～3个菌体相连，无芽孢。

2.3 生化鉴定

将分离到的68个菌株，经生化试验鉴定，符合大肠杆菌特征见表1。

表1 分离菌生化试验结果

2.4 致病性实验

大部分雏鸡6 h以后开始出现症状，表现精神沉郁，食欲下降，多数出现腹泻，有的出现神经症状。接种12 h后开始出现死亡。剖检死亡鸡，表现为典型大肠杆菌病病变，并从死亡鸡病变组织均回收到相应接种致病菌株。在分离的68株菌中确认56株为致病性菌株，占分离菌株的82.35%。

2.5 药敏试验

其中阿米卡星、头孢哌酮、氟苯尼考敏、磷霉素钠敏感率达到85%以上，而四环素、链霉素、阿莫西林等药物的敏感性较低。统计情况见表2。

表2 耐药性实验结果统计

3 讨论

3.1 关于实验结果

从临朐县畜牧局动物门诊日常疑似病例抽取的68只病鸡中分离出68株菌株，涂片镜检、生化试验等方法分离鉴定，均符合大肠杆菌特征，确定全部为大肠杆菌。经致病性动物试验，共56株菌为致病性大肠杆菌。说明本地区鸡大肠杆菌的致病率与致死率都很高，需要本地区的养殖户必须提高警惕与做好防范措施。

3.2 药物防治

药敏实验发现，本地区鸡致病性大肠杆菌对阿米卡星、头孢哌酮、氟苯尼考、磷霉素钠有较高的敏感性，可考虑投入临床使用；而四环素、链霉素、阿莫西林等药物的敏感性较低，该区养殖户应慎用或不用。该区养殖户还应注意正确的用药措施，长时间使用一种药物易产生耐药性，细菌耐药性的发生和发展正是抗菌药物广泛应用，特别是滥用药物的结果。因此广大养殖户在治疗大肠杆菌病时必须注意用药问题，加强抗菌药物的质量监督，合理选用药物，在有限的条件下尽量避免耐药菌株的产生。所以选择药物时必须先进行药敏试验，应尽量采取“交替”的用药方案，可在发病日龄前1～2d进行预防性投药。近些年来，利用中草药防治鸡大肠杆菌病取得了明显的效果。目前业内已有报道，用清瘟败毒散、复方黄连口服液、禽菌灵、大肠杆菌净等药物对大肠杆菌性腹泻治愈率达80%以上。

3.3 疫苗免疫

由于大肠杆菌血清型多，不同血清型抗原性不同，因此市场上的疫苗具有一定的局限性。在常发病的养禽场，有条件的可从本场病禽中分离出致病性的大肠杆菌，制成自家多价灭活疫苗。建议在雏鸡7～15日龄、25～35日龄、120～140日龄各免疫1次。