猪伪狂犬病活疫苗(HB-98株）的分子特性与免疫效果分析

汤细彪，刘峰，谌磊，喻红艳，尚书,满小营，陈楚雄，吴斌

(1.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070；2.华中农业大学动物传染病诊断中心，湖北武汉 430070）

伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是危害全球养猪业最严重的急性传染病之一。猪伪狂犬病的临床症状主要表现在：（1）母猪流产、产死胎、木乃伊胎；（2）公猪感染睾丸肿胀、萎缩，失去种用能力；（3）新生仔猪的死亡，仔猪的顽固性腹泻，保育猪呼吸系统综合症；（4）育肥猪呼吸困难，生长延缓。该病在猪群中常呈暴发性流行，影响各个阶段的猪群的生产性能。我国自1948年刘永纯首次报道该病以来，迄今已有近20多个省、市（区）相继报道发生该病，对我国的养猪业，尤其是集约化养猪带来了巨大的经济损失。疫苗免疫接种是预防控制与消灭猪伪狂犬病的根本措施，全球已有许多国家用不同方法培育了不少伪狂犬病弱毒株，这些疫苗在控制和净化本国伪狂犬病中起到了非常重要的作用，本文将对我国最早研发、具有完全自主知识产权的猪伪狂犬病活疫苗(HB-98株)的分子特性及应用效果进行介绍。

一、猪伪狂犬活疫苗(HB-98株）的研发背景

伪狂犬病最早是由匈牙利的Aujeszky博士于1902年发现。我国首次报道该病是在1948年。20世纪80年代以后关于本病发生的病例数逐年增多，至20世纪90年代蔓延至20多个省市，在各个省份均出现暴发性流行（猪场的伪狂犬阳性率高达80%）。给全国的养猪业带来巨大的损失。正是在这样的背景下，华中农业大学动物传染病实验室在全国范围内开展了猪伪狂犬病毒的分离和疫苗研发工作，并率先在我国流产母猪子宫内膜炎分泌物中分离鉴定出伪狂犬野毒，并命名为鄂A株，随后以鄂A株为种毒，应用分子基因工程技术、反复筛选、大量临床试验，研制出具有完全自主知识产权的猪伪狂犬活疫苗HB-98株（TK-/gG-/gE-三基因缺失疫苗株）。

二、伪狂犬病毒基因工程疫苗(HB-98株)的分子特性

（一）安全的伪狂犬病毒基因工程疫苗须缺失TK基因作为弱毒活疫苗首先必须是安全的。欧盟提出的伪狂犬病疫苗安全性的要求包括：无局部和全身性反应；不扩散到非免疫猪；不能通过精液和胎盘传播；致弱必须是彻底的不返强。

胸苷激酶(TK)基因位于UL区，功能为催化脱氧胸苷磷酸化。TK基因是疱疹病毒的一个主要毒力基因。TK基因的失活大大地降低了病毒毒力而不影响病毒在组织培养中的增殖，该基因对于病毒在中枢神经系统中的复制起着主要作用。因此安全的伪狂犬病基因工程疫苗须缺失TK基因。而且通过基因工程手段完全缺失TK基因的疫苗毒株在临床应用中不会出现毒力返强的现象。相反，通过自然致弱的毒株没有缺失TK基因，如Bartha K-61株在使用过程中就曾出现过疫苗毒株和野毒重组后发生毒力返强的现象。

（二）伪狂犬病毒gG基因的缺失可激发机体产生非特异性细胞免疫 伪狂犬病毒编码的gG(gX)蛋白是一种趋化因子结合蛋白，gG蛋白通过结合趋化因子使趋化因子不能发挥功能，导致机体不易或难以识别侵入的病毒。缺失gG基因可以大幅提高疫苗激起的细胞免疫。gG基因缺失的疫苗毒株感染动物后，可提升了非特异性细胞免疫，进而游离的趋化因子浓度较未缺失gG基因的野毒株要高，起到快速清除野毒的能力。同时，gG基因的缺失可以进一步提高活疫苗的安全性。Peeters(1993)证明仅单独缺失gE或TK基因的毒株经鼻腔免疫后可从接种猪传播至同群饲养的非免疫猪；但TK-/gG-/gE-三基因缺失株在非免疫猪群中则不会传播。所以TK-/gG-/gE-三基因缺失毒株具有更高的安全性。

（三）gE基因的缺失可应用于伪狂犬病毒的临床鉴别诊断与疫病净化 gE糖蛋白对病毒在神经系统中包括三叉神经节和嗅神经的扩散中发挥重要作用，但不是PRV生长所必需。所以，gE基因缺失可以进一步提高疫苗的安全性。gE-PRV毒株免疫的猪血清中，不产生针对gE糖蛋白抗原表位的抗体，而自然感染野毒株后，则可产生抗gE表位的抗体，因此通过检测针对gE蛋白的抗体水平可以区分gE-PRV疫苗免疫猪和野毒自然感染猪，是监测PR免疫接种和根除PR最常用的工具。

表1 伪狂犬病活疫苗HB-98株与Bartha株的区别

（四）HB-98株与其它伪狂犬疫苗毒株的分子差异性分析 猪伪狂犬病活疫苗HB-98株与国外的伪狂犬病活疫苗的主要区别体现在疫苗毒株的遗传背景、基因改造技术、免疫原性和安全性上。首先，国外传统疫苗主要使用的Bartha K-61株和Bucharest株，这两株病毒均分离自欧洲，与我国的流行毒株在遗传背景上相差较大。其次，这些毒株是通过在鸡胚上自然盲传获得的，缺失主要毒力基因的目标性不强，随意性较大，且并没有缺失TK基因，存在毒力返强的风险。再次， gG基因没有缺失，不能有效的产生非特异性细胞免疫。其主要分子差异见表1。

三、HB-98株可产生α和β干扰素，具有广谱抗病毒作用

干扰素具有广谱的抗病毒作用。机体在早期的病毒感染期间，干扰素即可控制病毒的生长和增殖。同时干扰素一方面可直接激活免疫细胞，另一方面可间接抑制病毒的复制过程。除此之外，干扰素还可以活化自然杀伤细胞和巨噬细胞，并且也会在机体内显示出有效的T淋巴细胞与B淋巴细胞佐剂的作用。

伪狂犬病毒编码的gG蛋白是一种趋化因子结合蛋白，由于gG蛋白与机体本身的趋化因子结合，使趋化因子不能发挥功能，导致机体不易或难以识别侵入的病毒。所以缺失了gG基因的HB-98活疫苗能迅速激发细胞免疫，产生大量的α和β干扰素（图1,图2），从而达到对病毒性疾病的治疗效果。经过长时间的临床实践证实，HB-98激起的非特异性细胞免疫对仔猪腹泻有很好的防控效果。

四、伪狂犬病毒基因工程疫苗(HB-98株）的临床应用

猪伪狂犬病活疫苗HB-98株构建于1998年。经过8年实验室试验和临床试验，于2006年获得国家新兽药注册证书和生产许可证。在8年的实验室试验和临床试验期间， HB-98株表现出稳定性高、针对性强、安全性好、免疫原性强等特点。