珍菊降压片中西药物配伍对高血压相关基因表达的影响﹡

朱国琴 张 聪 蔡国琴 王建新

1.复旦大学药学院，上海 201203；2.上海市中药研究所，上海 201401

珍菊降压片系中西药物复方降压制剂，由野菊花浸膏、珍珠层粉及芦丁三味中药（或提取物）和氢氯噻嗪与盐酸可乐定两味西药成分组成，是临床上治疗轻中度原发性高血压的常用药物之一[1]。高血压病作为临床上的常见病、多发病，长期服用有效的降压药，仍是目前防治的主要措施之一。虽然目前临床上用于抗高血压的药物较多，化学药物虽然起效较快，但普遍存在较大的副作用；中药药性较为温和，但相对来说起效较慢，效果不够显著。珍菊降压片就是在将中西药物的特点结合起来的思路指导下研制而成的，诸多临床试验也证实了其组方的合理性，无论是单独作为降压药，还是与其他药物联合应用，都表现出了良好的效果。方中用野菊花清热降火、清利头目、平肝降压；珍珠层粉平肝潜阳、安神定惊、清热明目，共为主药。盐酸可乐宁具有中枢降压作用，氢氯噻嗪为利尿降压药，共为辅药。芦丁降低毛细血管通透性，增加其张力为佐使药，诸药合用共奏平肝、潜阳、清热、降压之功。黄琳红等[2]进行的肾性高血压大鼠实验显示，珍菊降压片有良好的抗高血压作用，且未出现西药组分引起的停药后血压反跳现象，对血脂和血脂蛋白无显著性影响，说明中药组分对抗了西药组分的不良反应。但目前关于珍菊降压片等中西复方制剂的中西药物配伍应用作用机制研究报道很少[3]，本研究采用血清药理学的方法，通过拆方研究，探讨珍菊降压片中西药物配伍后对高血压相关基因表达的影响，探讨其配伍机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 ICR小鼠（SHR）80只，雌雄各半，体重18～20 g，购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SYXK（沪）2003-0029。

1.1.2 受试药物 珍菊降压片原料药（简称：复方，下同），土褐色粉末，由上海雷允上药业有限公司提供，将野菊花膏粉、珍珠层粉、芦丁、氢氯噻嗪、盐酸可乐定按100∶100∶20∶5∶0.03比例混匀，然后用0.5%CMC蒸馏水液调配成1.4%的药液，备用。

1.1.3 对照药物 对照药物1∶珍菊降压片中药部分（简称∶中药，下同），土褐色粉末，由上海雷允上药业有限公司提供，将野菊花膏粉、珍珠层粉、芦丁按100∶100∶20比例混匀，然后用0.5%CMC蒸馏水液调配成1.37%的药液，备用。对照药物2：珍菊降压片西药部分（简称：西药，下同）白色粉末，由上海雷允上药业有限公司提供，将氢氯噻嗪、盐酸可乐定按500：3比例混匀，然后用0.5%CMC蒸馏水液调配成0.03%的药液，备用。

1.1.4 细胞株 人脐静脉内皮细胞株ECV-304，来源于复旦大学遗传工程国家重点实验室。

1.1.5 试剂 流式细胞仪检测用试剂：碘化丙碇（鼎国），triton-X100（生工）芯片检测用试剂：GeneChip Expression 3’Amolication One-Cycle Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix）；RNeasy Mini Kit（50）（QIAGEN）；Trizol（Invitrogen）；DEPC-water（Ambion）；Herring Sperm DNA（Promega）；BSA（Inventrgen）；MOPS（Sagon）；β-Mercaptoethanol（Sagon）；Normal Goat IgG（Sigma）；Biotinylated Antibody（VectorLabs）；MEA Free Acid Monohydrate SigmaUltra（Sigma-Aldrich）；MES sodium salt（Sigma-Aldrich）；10%Tween-20（Pierce）；SSPE（Cambrex）；R-Phycoerythrin Streptavidin（Invitrogen）；DMSO（Sigma）

1.1.6 基因芯片 Human Genome Y133 Plus 2.0（Affymetrix）。

1.1.7 检测仪器 高速离心机（LABOFUGE400R型）；电子天平（AL204型，Metter Toledo）；荧光倒置显微镜（XDS-1B，重庆光电仪器厂）；流式细胞仪（FCESCalibur型，B&D）；GeneChip System（Affymetrix）。

1.2 实验方法

将ICR小鼠按体重分为4组，每组20只，设复方组，复方组分中相应剂量中药组、西药组，空白对照组。复方、中药、西药三组分别灌胃给予复方280 mg/kg、中药274 mg/kg、西药6.2 mg/kg，空白对照组灌胃给同体积0.5%CMC蒸馏水液20 mL/kg，每日1次，连续7 d。末次给药后2 h，小鼠眼眶动脉处取血，血液凝固、收缩后，4℃状态下离心，分离含药血清，备用。

选取生长状况最好的ECV-304人脐静脉内皮细胞1传4，24 h后，将中药、西药、复方及对照组动物血清过滤，分别取250μL血清加入至含10%胎牛血清的5 mL培养基中，使其终浓度为5%，于37℃孵育箱培养，24 h后观察细胞表型，用荧光倒置显微镜拍摄细胞形态，流式细胞仪检测细胞周期，并抽提ECV-304细胞RNA，反转录，Cy3标记和Cy5标记，送样作Affimatrix表达谱芯片分析。

2 实验结果

2.1 细胞表型变化

荧光倒置显微镜下观测可见，ECV-304细胞经含药血清培养基培养，其形态与生长密度无明显改变，但各组细胞内的颗粒物有所增加，说明珍菊降压片在动物体内代谢后释放入血清的物质会影响细胞表型，但无明显毒性。细胞的荧光照片见图1。

图1 添加不同小鼠血清培养基培养的细胞形态

2.2 细胞周期变化

细胞的周期间期是以DNA合成为标志，可分为G1期，S期和G2期。G1期是指DNA合成前期，主要进行细胞体积的增大，并为DNA合成作准备，S期主要是指细胞DNA合成期，染色体数目在此期加倍，G2期为DNA合成后至细胞分裂开始之前的第二个间期，为细胞分裂作准备。S期是细胞能否增殖的重要阶段。

流式细胞仪检测可见，与空白对照组相比，加入含药血清后中药组、西药组G1期细胞百分比均显著下降（P＜0.05），S期细胞百分比均显著增加（P＜0.05），复方组G2期细胞百分比显著下降、S期细胞百分比显著增加（P＜0.05），显示中药、西药或复方中的成分可促进细胞增殖。结果见表1、图2。

表1 含药血清对细胞周期变化及细胞凋亡的影响（±s，n=20）

表1 含药血清对细胞周期变化及细胞凋亡的影响（±s，n=20）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

血清类型 不同周期细胞率（%）G1 G2 S空白对照组 52.24±1.95 7.87±1.90 39.90±0.41中药组 43.18±1.60** 8.73±0.40 48.09±1.37**西药组 44.66±3.57* 8.71±2.20 46.62±1.39**复方组 46.80±3.57 4.44±0.60* 48.76±2.24**

图2 含药血清处理24 h后处于不同周期的细胞百分比

2.3 基因表达变化

ECV-304细胞经含药血清培养基培养后，有多组基因出现表达显著上调或下调。其中，中药组基因显著变化（上调或下调）有63条，西药组94条，复方组186条。而可能与高血压相关的候选基因显著变化者，中药组有18条，西药组30条、复方组51条。

中药含药血清作用于细胞后表达显著上调的可能与高血压相关的侯选基因有13条，分别为血管活性多肽及其受体（SMO、KLK13、AGTR1），生长因子、细胞因子及受体（CCBP2、IL8、PTX3），盐敏感基因、转运蛋白及离子通道（ATP7B），细胞增殖、凋亡相关基因（RRP22、RASSF3），转录因子、发育相关分子（PROSC、ELL2、PBX2），细胞信息传递分子（NTRK3）。中药含药血清作用细胞后表达显著下调的可能与高血压相关的侯选基因5条，分别为细胞增殖、凋亡相关基因（DAP3），应激分子及细胞外基质（COL8A1），转录因子、发育相关分子（MIER3），脂代谢分子（DPP6），黏附分子及受体（AKAP10）。

西药含药血清作用细胞后表达显著上调的可能与高血压相关的侯选基因16条，分别为生长因子、细胞因子及受体（ECGF1、CCL16、CXCL2、CCL20、IL8、PTX3），细胞增殖、凋亡相关基因（ANKRD30A、CDCA7、CCAR1、DIDO1），应激分子及细胞外基质（CRHR1），转录因子、发育相关分子（TRERF1、NFX1、HDAC6），细胞信息传递分子（ERN1），脂代谢分子（IDH1）。西药含药血清作用细胞后表达显著下调的可能与高血压相关的侯选基因14条，分别为血管活性多肽及其受体（EDG2），生长因子、细胞因子及受体（RPS6KA6），盐敏感基因、转运蛋白及离子通道（ATP1A4、GNPTAB），细胞增殖、凋亡相关基因（CCNG2），应激分子及细胞外基质（COL8A1），转录因子、发育相关分子（ATF7、MESDC2、GATS、MIER3），细胞信息传递分子（SLC7A3、ADRA1A），脂代谢分子（DPP6），黏附分子及受体（PCDH9）。

复方含药血清作用细胞后表达显著上调的可能与高血压相关的侯选基因46条，分别为血管活性多肽及其受体（SMO、KLK13、AGTR1），生长因子、细胞因子及受体（CCBP2、IL8、PTX3、TGFBR1、IRAK1BP1、FGF22、GABRQ、ECGF1、CCL20、CXCL1、GNB2L1、GPR125、CXCL2、CRIM1、CXCL6、FOLR1、SSR4、EGFR），盐敏感基因、转运蛋白及离子通道（ATP7B、GLYATL1、ATPVOA1、PITPNB、SLC25A37），细胞增殖、凋亡相关基因（RSU1、PDCD5、BLRC3），转录因子、发育相关分子（HDAC9、TFAP2B、PBX1、CRSP8、TAFIC、SFRS5、NFX1、SFRS4、TFCP2），细胞信息传递分子（NTRK3、ARHGDIB），脂代谢分子（IDH1、ZAP70、ELOVL5、PRKAA1、IMMT），粘附分子及受体（ITGB3）。复方含药血清作用细胞后表达显著下调的可能与高血压相关的侯选基因5条，分别为生长因子、细胞因子及受体（HSD3B1），盐敏感基因、转运蛋白及离子通道（LARGE），转录因子、发育相关分子（MIER3），细胞信息传递分子（RUNX1，CPEB2）。

经对比分析，可能与高血压相关的侯选基因中，中药组和复方组共同表现显著上调的基因8条，分别为血管活性多肽及其受体（SMO、KLK13、AGTR1），生长因子、细胞因子及受体（CCBP2、IL8、PTX3），盐敏感基因、转运蛋白及离子通道（ATP7B），细胞信息传递分子（NTRK3），共同表现显著下调的基因1条，为发育相关分子（MIER3）；西药组和复方组共同表现显著上调的基因7条，分别为生长因子、细胞因子及受体（ECGF1、CXCL2、CCL20、IL8、PTX3），转录因子、发育相关分子（NFX1），脂代谢分子（IDH1），共同表现显著下调的基因1条，为发育相关分子（MIER3）；中药组、西药组和复方组共同表现显著上调的基因2条，为生长因子、细胞因子及受体（PTX3、IL8），共同表现显著下调的基因1条，为发育相关分子（MIER3）。

3 讨论

珍菊降压片及其组方中中药和西药部分以2.8倍临床使用剂量连续7 d口服给药，其小鼠血清对ECV-304细胞无明显毒性作用，但可促进其增殖。从基因表达变化可见，中药组、西药组及复方组表现出多靶点的作用特点。中药组、西药组、复方组有着相同的和不同的基因表达变化，其中有一些可能与高血压发生发展的各种因素密切相关，包括与脂代谢、血管活性多肽及其受体、盐敏感基因、转运蛋白及离子通道、生长因子、细胞因子及受体、细胞信息传递分子等相关的基因表达变化，从中显示了其治疗高血压的活性靶点及作用机理。复方组表现出不同于中药组、西药组的作用靶点，复方组上调基因个数大于中药组、西药组各自上调基因之和，复方组下调基因个数小于中药组、西药组分别下调基因之和，提示处方中中西药物配伍后发挥出不同于单独使用中药、西药的作用。

本研究对珍菊降压片中西药物配伍后对ECV-304人脐静脉内皮细胞可能与高血压相关的候选基因的表达变化作了初探，随着高血压相关基因研究的不断深入，将对珍菊降压片中西药配伍后对高血压相关基因的表达进行进一步更深入地研究。

[1] 吴跃进，黄湘.中西药复方降压药珍菊降压片的研究与应用概况[J].中国中医基础医学杂志，2005，11（3）：238-241.

[2] 黄琳红，袁秉祥，贺建宇，等.珍菊降压片对肾性高血压大鼠血压的影响[J].西安交通大学学报（医学版），2003，24（6）：615-617.

[3] 左铮云，卢毓雄，吕爱平.应加强中西药配伍的基础研究[J].中国中医基础医学杂志，2005，11（11）：861-862.