福建省非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC)的发现及某些分子特征的研究

陈爱平,陈建辉,杨劲松,林 杰,郑金凤,严延生

在所有能够引起人类发病的大肠杆菌中,肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichia coli,EPEC)通常被认为主要引起发展中国家婴幼儿腹泻[1]。在1995年巴西圣保罗召开的第二届国际EPEC大会上[2],与会者对 EPEC定义达成共识,“EPEC为致泻性大肠杆菌,在小肠细胞产生特有的粘附和脱落(A/E)组织病理损伤,不产生志贺、志贺样或vero毒素”。基于EPEC携带的毒力基因的不同,将 EPEC分为典型的致病性大肠杆菌(tEPEC)和非典型的致病性大肠杆菌(aEPEC),tEPEC菌株含有紧密素(intimin)eaeA和束状菌毛bf p基因,而aEPEC菌株只含有eaeA基因。eaeA位于肠细胞脱落位点(L EE)毒力岛上,病原菌所致A/E损伤的所必需基因都位于L EE毒力岛上,bf p基因位于 EPEC粘附因子质粒(EAF)上,因此 tEPEC和aEPEC菌株是有共同L EE毒力岛的不同生物体[3-4],同时人是tEPEC唯一的宿主,aEPEC却是人和动物都可以成为宿主[5],aEPEC被认为是一种新发的传染病病原[3]。

aEPEC菌株作为新出现肠道致病菌,世界各地均有检出。aEPEC菌株与工业发达国家腹泻爆发有关(成人和儿童),也见于发展中国家和发达国家散发腹泻病例。目前,多个国家发现aEPEC发病率高于tEPEC[6-10]。在一些发展中国家如巴西、印度、墨西哥的调查数据表明,腹泻病例中aEPEC比例相对高于tEPEC[3,11-12]。国内关于aEPEC鲜有报道,更缺乏该病原菌流行状况的本底资料。

2010年10月我们从一死婴病例的粪便中分离鉴定出非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC),且是培养分离优势生长菌,这是福建省首次发现该病原,本研究的目的是了解该病原菌的菌株特征,为进一步开展aEPEC的研究工作提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 病例描述 该病例死亡前1～2 d无排便、进食差、腹胀明显、叩诊腹部鼓音。临终前4～5 h呻吟、肚子胀明显,死亡前1 h腹泻1次,呈蛋花样,无呕吐。

1.2 标本的常规分离培养 将保存在生理盐水为介质的肛拭原液直接划线接种于麦康凯平板(编号为2010137M-S1)和 SS平板(编号为 2010137SS1),37℃培养过夜。另外肛拭标本用沙门菌选择性亚硒酸盐亮绿磺胺增菌液(SBG)过夜增菌后,划线接种于SS平板,37℃培养过夜。

1.3 生化鉴定 采用梅里埃公司生产的API 20E生化鉴定条以及广东环凯微生物科技技术有限公司生产的微量生化鉴定管。

1.4 血清学诊断 采用玻片凝集,诊断血清的生产厂家为宁波天润,在有效期内使用。

1.5 药敏试验 采用 K-B法。

1.6 实时荧光PCR(RT-PCR) 五类致泻性大肠杆菌(ETEC EPEC EHEC EIEC EAEC)的实时荧光诊断试剂盒及其它的13种常见食源性致病菌诊断试剂盒购自上海之江生物科技有限公司,模板DNA的提取及实时荧光PCR的反应体系及扩增程序按照试剂盒使用说明书。本文中所用的引物序列依据相应文献描述,引物资料见表1,寡核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。常规PCR反应均采用20μL的反应体系,除了特殊说明,各组成成分的终浓度分别为:Ex Taq DNA聚合酶 0.5 U,dNTP 200μmol/L ,上游引物 0.4 μmol/L,下游引物 0.4μmol/L,DNA 模板 2μL。常规PCR扩增程序:预变性 94℃5min,94℃30 s 55℃30 s 72℃30 s,循环25次;补平 72℃5 min。

1.7 模板的制备 直接吸取肛拭原液(保存介质为生理盐水)500μL,100℃煮沸裂解10min,13 000r/min离心5min,取上清做为实时荧光 PCR检测的DNA模板(编码为DNA-S1)。分纯的细菌,直接刮取适量的细菌于 300μL的纯水制备成菌悬液,100℃煮沸裂解10min,13 000r/min离心5min,取上清做为实时荧光PCR及常规PCR检测的DNA模板。

表1 基因及引物序列表Table 1 G enes and primer sequences in this study

1.8 试剂仪器 Ex Taq DNA聚合酶、dN TP购自大连宝生物工程有限公司,琼脂糖为BioAsia分装品,电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-6C型,读胶仪为上海培清生产的JS-380,PCR扩增仪为GStorm(GeneTech),实时荧光 PCR仪为Rotor-gene 6000(Corbett)。

1.9 DNA序列的测定及比较 序列测定由上海生工完成,248bp的PCR扩增产物进行双向测序后用DNAStar分析软件进行拼接,校正后的序列在NCBI网站上进行核苷酸的Blast比较。

2 结 果

2.1 从肛拭原液直接提取的DNA标本(DNAS1),实时荧光 PCR(RT-PCR)检测病原菌基因的结果。

2.1.1 实时荧光检测标本DNA-S1五类致泻性大肠杆菌基因,结果为 EPEC-A(+)、EPEC-B(-),EHEC-stx1(-)、EHEC-stx2(-),ETEC-ST(-)、ETEC-L T(-),EIEC(-),EAEC(-)。

2.1.2 DNA-S1标本其它常见的13种食源性致病菌(包括霍乱弧菌、伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、小肠结肠耶尔森氏菌、创伤弧菌、溶澡弧菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、O157∶H7)的相关基因RT-PCR检测均为阴性。本研究所有实时荧光及常规PCR的实验每个基因均设有阳性对照和阴性对照,阳性对照的结果均呈阳性,阴性对照的结果均呈阴性。

2.1.3 标本DNA-S1的RT-PCR病原菌基因检测结果表明 该标本中存在有 EPEC-A基因,而EPEC-B基因为阴性,根据试剂盒提供的判断标准,提示为不典型的肠致病性大肠杆菌(aEPEC)核酸检测阳性。

2.2 标本的常规分离培养 将保存在生理盐水为介质的肛拭原液直接划线接种于麦康凯平板和SS平板,过夜培养后平板上细菌生长情况如下:

2.2.1 麦康凯平板(编号为2010137M-S1)上有两种菌落,一为中等大、半透浊、圆形湿润呈优势生长,编号为2010137M①;另一种为较大、红心半透、圆形湿润菌落(后一种菌落依据菌落特征、克氏双糖铁、赖氨酸动力及血清凝集实验后排除掉肠道致病菌)。

2.2.2 SS平板(编号为2010137S-S1)上生长有两种菌落,一为中等大、半透、圆形湿润呈优势生长,编号为2010137S①;另一种为较大、红心边半透、圆形湿润菌落(后一种依据菌落特征、克氏双糖铁、赖氨酸动力及血清凝集实验后排除掉肠道致病菌)。

2.3 分纯菌株2010137M①和2010137S①的综合检测结果

2.3.1 生化鉴定 API 20E生化鉴定条鉴定结果为大肠埃希氏菌,同时用微量生化管手工鉴定也符合大肠埃希氏菌生化特征。具体生化反应特征为:葡萄糖⊕、乳糖+、麦芽糖+、甘露醇+、蔗糖-、靛基质 + 、甲基红+ 、VP-、枸椽酸盐-、尿素-、苯丙氨酸-、丙二酸盐钠-、水杨素-、氧化酶-、硝酸盐还原+、阿拉伯糖+、卫矛醇-、肌醇-、鼠李糖+、蕈糖+、木糖+、山梨醇+、鸟氨酸脱羧酶-、精氨酸双水解酶-、赖氨酸脱羧酶+、硫化氫-、ONPG+、氰化钾-。

2.3.2 血清学诊断 现有的典型的EPEC三种多价血清型均不凝集。

2.3.3 药敏试验结果 菌株只对四环素耐药、氨苄西林呈中度敏感,对于其它的实验药物均为敏感,包括头孢类药物(头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢噻吩),喹诺酮类(环丙沙星、萘啶酸),氨基糖甙类(庆大霉素、链霉素),磺胺类(磺胺、甲氧苄啶、复方新诺明),阿莫西林+棒酸和氯霉素。

2.3.4 分子生物学检测结果 运用RT-PCR检测2010137M①和 2010137S①分纯细菌 DNA的EPEC基因,结果均为 EPEC-A(+)、EPEC-B(-),提示菌株为不典型的肠致病性大肠杆菌(aEPEC)。同时运用 RT-PCR检测 EHEC基因,结果均为EHEC-stx1(-)、EHEC-stx2(-)。进一步运用常规PCR检测 EPEC的eaeA和bf p基因,结果为eaeA(+)、bf p(-),符合aEPEC菌株的诊断标准,同时检测可能相关的毒力因子paa和ehxA,均为阴性。

2.3.5eaeA基因的序列测定及结果分析 248bp的eaeA序列在NCBI上 GenBank核酸序列数据库中比对的结果均提示为大肠埃希氏菌(EHEC/EPEC)紧密素(intimin)的eaeA基因。

2.3.6 综合以上实验结果 2010137M①和2010137S①菌株判定为不典型的肠致病性大肠杆菌(aEPEC)。肛拭原液直接划线接种于麦康凯平板和SS平板上aEPEC均呈优势生长,说明在病例的粪便标本中该病原菌的数量是占优势的。

2.4 肛拭标本另用沙门菌选择性增菌液亚硒酸盐亮绿磺胺增菌液(SBG)过夜增菌后,划线接种于SS平板,从该平板上生长的菌落中检出鼠伤寒沙门菌。直接肛拭原液提取的DNA标本DNA-S1 RT-PCR检测沙门菌基因为阴性,同时肛拭原液直接接种于SS平板也没有检出鼠伤寒沙门菌,原因是该病原菌的数量比较少在使用方法的检测限制下,经SBG选择性增菌后,鼠伤寒沙门菌在SS平板上呈非优势生长。结果表明该病例存在细菌混合感染,但是否是由于细菌感染导致病例的死亡,需要病理解剖的结论。

3 讨 论

我们从1例8月龄的死婴粪便标本中分离到(aEPEC),为福建省首次从患者标本中检出这类菌株。

aEPEC和tEPEC的区别主要是在于都有eaeA基因,但是aEPEC缺少bf p基因。实时荧光 PCR结果提示:在肛拭子标本直接提取的核酸中存在非典型的肠致病性大肠杆菌核酸片段,对常规培养在麦康凯平板和SS平板上优势生长的菌落,运用实时荧光PCR鉴定出该病原菌为aEPEC。为了进一步证实该结果,我们运用常规PCR扩增分纯细菌的eaeA和bf p基因,结果也吻合aEPEC的病原菌特征,即eaeA基因阳性、bf p基因阴性。同时结合该病原菌生化鉴定的结果符合大肠埃希氏菌特征,现有的典型的EPEC血清群都不能凝聚,鉴定该病原菌为aEPEC(未分型)。这与国际上报道的目前大部分的aEPEC血清不能归于现有典型的 EPEC血清群的结果也是相吻合的[16]。eaeA序列测定后比对的结果也提示该基因是大肠埃希氏菌(EHEC/EPEC)紧密素(intimin)的eaeA基因。

在遗传关系上,aEPEC和肠出血性大肠杆菌(EHEC或STEC)更为密切,但是不含有类志贺毒素stx1和stx2。我们运用实时荧光PCR对该病原菌检测stx1和stx2基因的结果也均为阴性。关于aEPEC毒力的研究主要是基于 EHEC的毒力相关基因以及其它致泻性大肠埃希氏菌(DEC)相关毒力基因的鉴定。Afset等[7]在调查挪威腹泻病小孩中分离到的aEPEC菌株中发现属于 EHEC毒力岛OI-122(ef a1/lif A、nleB、nleE和sen)基因,及属于 EHEC菌株O113血清群的lpfA基因特别常见;其它的基因如猪A/E相关基因paa和 EHEC的溶血基因ehxA,也发现和aEPEC的腹泻病相关[15]。我们检测了paa和ehxA基因,发现我们分离的菌株均为阴性。Trabulsi等研究表明通常aEPEC菌株比tEPEC更有可能携带来自其它DEC的毒力编码基因[3]。Vieira、Gomes等证实不能划归于典型的EPEC血清群的aEPEC,其毒力基因的重组方式及来源形式更具多样性[17-18]。因为致泻性大肠杆菌编码毒力因子的基因可以是位于可以转移的质粒、PAIs(毒力岛)、转座子及细菌的噬菌体上,不同的毒力基因重组在aEPEC菌株中的发现不是什么奇怪的事,这些基因序列可以通过肠道内和(或)外环境进行水平的传递。另外,有些菌株可能是tEPEC丢失了 EAF质粒或者部分质粒,或者 EHEC在感染过程中丢失了stx噬菌体序列,aEPEC也可能是人特异A/E大肠杆菌部分独特的亚型;再或者是人感染了家养动物(牛、兔等)中缺失EAF质粒的EPEC菌株[5,16,19]。基于以上的情况,我们需要进一步检测其它毒力相关基因,并深入探讨这些基因和菌株致病力的关系。

关于aEPEC的研究报道国内比较少,我们拟进一步调查在腹泻病人及动物宿主中该病原菌的携带情况,分离更多类似菌株后进行分子流行病学、序列测定等研究,分析菌株间的遗传相似度、标志毒力基因等分子特征,为aEPEC的防治提供一些基础的本底资料。

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