细柱五加茎中6种化合物体外对人肺癌细胞株A549的生长抑制作用

惠秋娣，裴 慧，钱士辉*

(1.无锡市锡山医药有限公司，江苏无锡214024;2.江苏省中医药研究院，江苏 南京210028)

细柱五加(Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith)为五加科植物，在我国广泛分布，为传统中药，入药部位为干燥根皮，称五加皮，收载于中华人民共和国药典(2000年版一部)，具有补肝肾，祛风湿，强筋骨的功能，多用于小儿行迟，体虚乏力，水肿，脚气，风湿等的治疗［1］。目前，五加皮均采自野生，市场供应紧缺，为扩大细柱五加资源的综合开发利用，本课题组对细柱五加茎的化学成分进行了研究。对从其茎中分离得到16－α－羟－19－贝壳杉烷酸、16αH，17－isovaleryloxy－ent－kauran－19－oic acid、贝壳杉烷酸苷A、紫丁香苷、松柏苷、刺五加苷D等6个化合物进行体外抗肿瘤作用活性初步筛选，为进一步开发利用细柱五加资源提供参考。

1 材料

1.1 药品与试剂

16－α－羟－19－贝壳杉烷酸、16αH，17－isovaleryloxy－ent－kauran－19－oic acid、贝壳杉烷酸苷A、紫丁香苷、松柏苷、刺五加苷D，由本实验室制备，纯度均在98%以上;DMEM培养基(GIBCO，450542);新生牛血清(民海生物工程有限公司，080508);MTT(Amresco，0793);胰 酶 (Amresco，0458);二甲亚砜(Amresco，019D0404);5－氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司，0710052)。

1.2 细胞株

人肺癌细胞株A549，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.3 主要仪器

HERA Cell 150 CO2细胞培养箱(美国 Thermo公司);Zeiss Axio Observer A倒置相差显微镜(日本Olympus公司);Thermo Multiskan Spectrum酶标仪(美国Thermo公司);MH－1403平版振荡器(海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

2 方法

2.1 化合物的提取和分离

将江苏盱眙县产的细柱五加茎用溶剂提取、萃取、硅胶柱层析、Sephadex LH－20柱和ODS柱层析、MDS柱层析以及重结晶等分离纯化方法，从石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位分离得到化合物，通过理化性质和波谱方法鉴定结构分别为:16－α－羟－19－贝壳杉烷酸、16αH，17－isovaleryloxy－entkauran－19－oic acid、贝壳杉烷酸苷A、紫丁香苷、松柏苷、刺五加苷D，经HPLC法测定，含量均达到98%以上。

2.2 细胞培养

将人肺癌A549细胞用含10%灭活的小牛血清DMEM完全培养基，置于37℃饱和湿度、5%CO2培养箱内培养，细胞呈单层生长，达80%左右融合时传代，细胞消化采用0.25%的胰酶和0.02%EDTA混合消化液。所有实验均在细胞的对数生长期进行。

2.3 MTT法测定肿瘤细胞的存活率［2］

取对数生长期的A549细胞，用0.25% 胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化，用含10%小牛血清的DMEM培养基调整细胞密度5×104个/mL，接种至96孔培养板中，每孔100 μL细胞悬液，继续培养24 h后，吸弃培养液，更换含不同药物浓度(30，60，90 μmol·L－1)及溶剂对照的新鲜培养液，每个浓度设6个复孔，并设空白调零孔。继续培养48 h，每孔加入 10 μL MTT(5 g·L－1)，继续培养 4 h，吸弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，溶解结晶，用酶标免疫检测仪测定570 nm波长处的吸光度(A)，计算细胞生存率。细胞生长抑制率(%)=(A对照－A用药)/A对照×100%，相同的实验重复3次。

2.4 统计学分析

3 结果

不同剂量的化合物分别作用于人肺癌A549细胞48 h，用MTT法检测细胞的存活情况，发现化合物16－α－羟－19－贝壳杉烷酸、16αH，17－isovaleryloxy－ent－kauran－19－oic acid、贝壳杉烷酸苷A、紫丁香苷、松柏苷对人肺癌A549细胞均存在不同程度的抑制作用，抑制率与药物浓度的增加呈正相关，与不加药组对比均存在显著性差异(P＜0.05)。其中，贝壳杉烷酸苷A对人肺癌A549细胞的生长具有较强的抑制作用。当浓度为90 μmol·L－1时，细胞抑制率为 47.61%。16αH，17－isovaleryloxy－ent－kauran－19－oic acid、紫丁香苷对细胞的抑制作用弱，在浓度为90μmol·L－1时抑制率均低于20%，而刺五加苷D对人肺癌A549细胞的增殖抑制率与其浓度成负相关，随着浓度的增加细胞生长抑制率不断降低。结果见表1。

表1 化合物对A549细胞的生长抑制作用± s，n=6)

表1 化合物对A549细胞的生长抑制作用± s，n=6)

与正常对照组比较:*P＜0.05

分组 浓度(μmol·L －1)OD值 抑制率(%)30 1.76 ±0.07* 6.62 60 1.45 ±0.08* 23.05 90 1.36 ±0.16* 28.03 16αH，17－isovaleryloxyent－kauran－19－oic acid 0 1.89 ±0.06－－16－α－羟－19－贝壳杉烷酸空白对照30 1.85 ±0.13* 2.11 60 1.77 ±0.10* 6.35 90 1.67 ±0.11* 11.64贝壳杉烷酸苷A 30 1.65 ±0.09* 12.70 60 1.15 ±0.14* 39.15 90 0.99 ±0.01* 47.61紫丁香苷30 1.72 ±0.10* 8.90 60 1.67 ±0.09* 11.66 90 1.60 ±0.07* 15.37松柏苷30 1.45 ±0.06* 23.32 60 1.35 ±0.20* 28.62 90 1.29 ±0.11* 31.69刺五加苷D 10.70 30 1.51 ±0.15* 19.93 60 1.54 ±0.07* 18.34 90 1.69 ±0.05*

4 讨论

肿瘤是人类健康的第一杀手，治疗肿瘤还没有特效药。虽然通过手术和放化疗等治疗手段可使部分肿瘤患者走上康复之路，但对晚期或全身情况较差的肿瘤患者，手术也无能为力。放、化疗对某些病灶确实有效，但副作用较大，而且有一定的致畸、致突变等毒副作用，所以治疗肿瘤仍是一项十分艰巨的任务。中药含有多种化学成分，具有不同的生物学效应。中药治疗肿瘤历史悠久，有副作用小、成本低等特点，所以从中药中开发抗肿瘤成分是目前抗肿瘤研究的热点之一。

细柱五加(Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith)为五加科五加属植物，在我国广泛分布，为传统中药。古医书中有报道五加皮用于治疗骨癌、肝癌、肾癌等肿瘤的记载，但缺乏有关五加皮抗肿瘤的基础研究报道。单保恩用凝胶层析法初步分离、纯化了五加皮抗肿瘤成分，结果表明中药五加皮在体外对多种肿瘤细胞增殖有抑制作用，其抗肿瘤活性与一种分子量为64 kDa的蛋白质成分有关［3］。由于五加皮资源有限，历代对五加皮的应用均很混乱，致使疗效不一，市场上正品难求。基于同一药用植物不同药用部位常含有相同或相似的药用成分和生理活性，可扩大药源和寻找更多新的活性成分的原理，我们对其茎成分进行了抗肿瘤活性筛选。

化合物贝壳杉烷酸苷A对人肺癌A549细胞的生长具有较强的抑制作用，随着药物浓度的增加抑制率也逐渐增加，当浓度为90 μmol·L－1时人肺癌A549细胞生长抑制率达47.6%。16－α－羟－19－贝壳杉烷酸、16αH，17－isovaleryloxy－ent－kauran－19－oic acid、紫丁香苷、松柏苷对人肺癌A549细胞均存在不同程度的抑制作用，其中16αH，17－isovaleryloxy－ent－kauran－19－oic acid、紫丁香苷对细胞的抑制作用弱，高浓度时抑制率均低于20%。刺五加苷D(VI)对人肺癌A549细胞的增殖抑制率与其浓度成负相关，随着浓度的增加细胞生长抑制率不断降低。

本研究初步确定16－α－羟－19－贝壳杉烷酸、贝壳杉烷酸苷A、松柏苷为细柱五加茎中的抗肿瘤活性成分，为细柱五加资源的综合开发利用提供了依据。

［1］卫生部药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:化学工业出版社，2005:44.

［2］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，1977:1827.

［3］单保恩，李巧霞，梁文杰，等.中药五加皮抗肿瘤作用体内外实验研究［J］.中国中西医结合杂志，2004，24(1):55－58.