HLA-G在结肠癌外周血中的表达及其临床意义

徐亦君， 竺明晨

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率在我国恶性肿瘤中位居第五，严重危害人类健康。组织相容性白细胞抗原G(HLA-G)为非经典的HLA I类分子，是一种重要的免疫耐受分子，能抑制NK细胞和CTL细胞介导的细胞裂解以及T细胞增殖反应[1]。研究发现HLA-G在结肠癌组织中高表达[2]，其在肿瘤细胞中的异常表达被认为可能是肿瘤细胞得以逃避宿主免疫监视的手段之一[3-4]。HLA-G除了在结肠癌组织中表达外，在人类外周血单个核细胞中也有表达。本实验采用实时荧光定量PCR方法研究HLA-G在结肠癌患者外周血淋巴细胞中的表达，初步探讨其在结肠癌诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集南京市第一医院2010年11月至2011年5月外周血标本共189例。189例中结肠癌患者85例，其中男43例，女42例，年龄48～74岁，平均年龄62岁；经结直肠镜及病理确诊的结肠良性病48例(包括结肠息肉20例，溃疡性结肠炎28例)，其中男26例，女22例，年龄43～78岁，平均61岁；另56名为健康体检者作为正常对照，其中男35名，女21名，年龄56～79岁，平均58岁。

1.2 实验方法

1.2.1 PBMC的分离和总mRNA的提取 抽取2 mL外周血，EDTA-K2抗凝，淋巴细胞分离液分离PBMC。Trizol裂解并提取PBMC细胞总mRNA，通过甲醛琼脂糖变性电泳和紫外分光光度计分析RNA的质量和浓度。

1.2.2 第一链cDNA的合成 EP管中加入5×Reaction Mix 4 μL, Maxima Enzyme Mix 2 μL , RNA 2 μg，加入Nuclease-Free水至20 μL。PCR扩增仪(Thermo)上25℃10 min，50℃15 min，85℃5 min。储存第一链cDNA于4℃冰箱或立即PCR。

1.2.3 引物设计和合成 根据Genebank提供的基因序列，设计引物并比对其特异性。引物由上海生工生物技术公司合成。HLA-G引物如下：上游5′-CTGGTTGTCCTTGCAGCTGTAG-3′;下游5′-CCTTTTCAATCTGAGCTCTTCTTTCT-3′。内参基因β-actin引物如下：上游5′- GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′；下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。应用LightCycler1.5 (Roche)实时荧光定量PCR仪进行检测，反应体系20 μL包括：第一链cDNA 2 μL, 2×SYBR Green Mix 10 μL (Takara) ,10umol/L上下游引物各0.8 μL，去离子水6.4 μL。反应条件为95℃ 30 s、95℃15 s、58℃15 s、72℃45 s收集荧光，40个循环。产物经1.5%琼脂糖电泳分离，判断扩增产物特异性。

1.2.4 相对表达率(ratio) 将HLA-G、β-actin cDNA按5个梯度分别扩增，每个梯度分别扩增3个复孔并计算均值。采用内参基因(β-actin)来标准化HLA-G mRNA表达，HLA-G ratio=2-△△CT，△CT= CTactin-CTHLA-G，△△CT=△CTactin-△CTHLA-G。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行统计分析。相对表达率以中位数表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扩增效率

HLA-G和β-actin模板稀释后进行实时荧光定量PCR，HLA-G和β-actin mRNA的扩增效率分别为1.98和1.93，CT值和cDNA模板量对数值之间的相关性系数R2均为0.998。目的基因和内参基因的扩增效率相近，且CT值和cDNA模板量之间呈密切相关(见图1)。

图1 CT值和cDNA模板量对数值之间的相关性

2.2 相对表达率

正常对照PBMC HLA-G mRNA中位数的95%可信区间(CI)为[0.66, 1.41]，结肠癌患者HLA-G mRNA CI为[1.15, 2.68]，结肠良性病患者HLA-G mRNA CI为[0.56, 1.51]。结肠癌组的HLA-G mRNA相对表达率高于正常对照组(P=0.03)和结肠良性病变组(P=0.02)，结肠良性病变组和正常对照组中HLA-G mRNA的表达差异无统计学意义(P=0.66)，见图2。

图2 HLA-G mRNA 在正常对照组、结肠良性病变组和结肠癌组PBMC中的表达

3 讨论

HLA-G位于人第6号染色体短臂上，属于人类一种非经典的主要组织相容性复合体的Ⅰ类分子，目前已广泛被认为是一种免疫耐受分子，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞，可通过多种途径诱导产生母胎免疫耐受，保护胎儿正常发育，是维持正常妊娠的重要因子。HLA-G作为一种免疫耐受分子，除了在习惯性流产和移植排斥反应中的应用较多外，研究还发现HLA-G在结肠癌[2]、黑色素瘤[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]等多种肿瘤组织中高表达。HLA-G介导肿瘤细胞免疫逃避的方式主要靠抑制NK细胞、细胞毒性T细胞等细胞免疫效应细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，以及抑制Th1和增强Th2细胞因子的分泌来实现的[8]。相关研究已证实结肠癌肿瘤细胞表面HLA-G的表达及其在肿瘤发生发展中的作用，但是结肠癌患者外周血单个核细胞HLA-G的表达情况不是很清楚。

本研究通过采集结肠癌患者静脉血并提取单个核细胞，采用实时荧光定量PCR的方法检测HLA-G在结肠癌患者PBMC中的表达发现：HLA-G在结肠癌外周血单个核细胞中表达高于健康人群(P=0.03)和结肠良性病变患者(P=0.02)。此结果同结肠癌组织中HLA-G的表达情况一致。LeBouteiller等[9]发现外周血中可溶性HLA-G 可与细胞毒性T细胞结合，阻止T 细胞与经典HLA-Ⅰ类抗原结合，抑制细胞毒性T细胞第一活化信号的产生，从而导致细胞毒性T细胞不产生细胞毒性杀伤作用。我们推测外周血单个核细胞中HLA-G所起的作用可能也是介导肿瘤细胞逃避免疫杀伤，但具体机制是否同可溶性HLA-G的作用相似，尚有待进一步研究验证。

手术切除是目前治愈结肠癌的有效方法，诊治越早患者的生存率就越高。但多数患者就诊时已处于进展期，虽然接受了如化疗、放疗等辅助治疗，但仍避免不了复发、转移等导致治疗失败。因此，寻找可靠有效的结肠癌肿瘤生物标志物是当前亟待解决的关键问题。本研究结果显示结肠癌患者的PBMC HLA-G mRNA表达较健康人和结肠良性病变者升高，所采用的实时荧光定量PCR方法具有方便采集和无创性等特点，方法简单可靠，成本低廉，可成为一个新的结肠癌分子标志。

综上所述，HLA-G在结肠癌患者外周血单个核细胞中表达升高，与结肠癌的发生和发展密切相关。检测外周血单个核细胞中HLA-G的表达对结肠癌的早期诊断和评估预后具有重要意义。

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