多指标综合评分法优选红花提取液醇沉工艺

袁 佳,李页瑞,陈 勇,王龙虎,刘雪松

多指标综合评分法优选红花提取液醇沉工艺

袁 佳,李页瑞,陈 勇,王龙虎,刘雪松

(浙江大学药学院,浙江杭州 310058)

目的：研究并确定红花提取液的最佳醇沉工艺。方法：以羟基红花黄色素 A(HSYA)转移率为评价指标进行单因素试验,分别考察终点乙醇质量分数、搅拌速度、药液初始质量浓度、醇沉温度和药液 pH等因素的影响。选取对单因素试验结果影响较大的 4个因素,采用 L9(34)正交试验法,以HSYA转移率、浸出物得率和纯度为指标进行综合评分,确定红花提取液醇沉的最佳工艺条件。结果：红花提取液的最佳醇沉工艺条件为终点乙醇质量分数 50%,药液初始质量浓度 1.15 g/ml,搅拌速度 500 r/min,药液 pH 5.0。结论：优选的工艺操作简便、稳定,HSYA转移率、浸出物得率和纯度较高。

红花 /分离和提纯;沉淀;正交试验;中药制药工艺 /方法

[J Zhejiang Univ(Medical Sci),2011,40(1)：27-32.]

红花为菊科植物红花 (Carthamus tinctorius L.)的干燥花,性味辛温,具有活血通经、散瘀止痛功效[1]。红花主要含查耳酮类、黄酮类、酚酸、脂肪酸、挥发油、聚炔等化学成分[2],主要活性组分之一是红花黄色素 (safflower yellow,SY),其中以羟基红花黄色素 A(hydroxy safflower yellow A,HSYA)含量最高。研究表明,HSYA具有降压、扩张血管、抑制血小板聚集及抗凝、抗氧化、抗肿瘤和脑保护等作用[3]。因此,开发 HSYA系列制剂及产品,对提高人民的健康水平具有重要意义。为提高红花制剂的疗效,富集纯化 HSYA至关重要,其中醇沉过程是关键步骤之一。近年来,对水溶性的 HSYA常利用大孔吸附树脂进行分离纯化[4-5],但纯度不高。目前,关于红花水提液醇沉工艺的研究报道较少,而且已有报道对考察的影响因素不够全面,评价指标较为单一[6]。本研究在单因素试验结果基础上,结合正交试验和多指标综合评分法对红花提取液的醇沉工艺进行优化研究,考察因素和评价指标较全面,在实验条件下优选出的醇沉工艺具有 HSYA转移率高、浸出物得率和纯度高等优点,有广泛的工业化应用前景。

1 材 料

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪配置四元泵、在线脱气装置、自动进样器、紫外检测器、柱温箱和 Chemstation工作站;JJ-1增力电动搅拌器为金坛市杰瑞尔电器有限公司产品;METTLER-AE240型电子天平为上海梅特勒-托利多仪器有限公司产品,THD-06Q低温恒温槽为宁波天恒仪器厂产品。

1.2 试药 红花提取液 (天津红日药业股份有限公司,药液质量浓度 1.182 g/ml)、羟基红花黄色素 A对照品 (成都曼斯特生物科技有限公司,批号 A0803)、色谱纯甲醇 (Merck,Germany),色谱纯乙腈 (Merck,Germany)、Millipore超纯水,其余试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 红花药液的配制 取红花提取液适量,加水稀释,用密度计测量,分别配制成质量浓度为1.15 g/ml、1.10 g/ml、1.05 g/ml和 1.00 g/ml的红花药液。

2.2 醇沉工艺操作 实验过程在洁净烧杯中进行,精密量取 10 ml红花药液,在搅拌下往药液中匀速加入 95%乙醇,乙醇加完后将烧杯封口,静置冷藏 24 h,取上层清液测定 HSYA含量。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB C18柱 (4.6 mm ×250 mm,5μm);流动相 ：甲醇 -乙腈-0.7%磷酸溶液 (26∶2∶72,V/V/V);流速：0.7 ml/min;检测波长：403 nm;柱温：30℃;进样量 ：10μl。

2.3.2 标准曲线的制备 精密称取 3.50 mg羟基红花黄色素 A对照品,置 5 ml量瓶中,加20%乙腈-水 (V/V)溶解并定容至刻度,分别稀释配制成质量浓度为 350μg/ml、175μg/ml、140μg/ml、70μg/ml、35μg/ml、17.5μg/ml的对照品溶液,按“2.3.1”色谱条件进样测定峰面积。以峰面积为横坐标 (X),浓度为纵坐标(Y),绘制标准曲线,所得曲线的回归方程为 Y=0.0319X-0.5179,R2=0.9996,表明 HSYA在 0.175～3.5μg范围内线性关系良好。

2.3.3 供试品溶液含量测定 按正交试验条件进行醇沉实验,醇沉后的药液静置冷藏 24 h,取上清液 1.0 ml置 25 ml量瓶中,加纯水定容,经 0.45μm微孔滤膜,按“2.3.1”项下色谱条件,测定 HSYA含量。

2.3.4 HSYA转移率 计算方法：

2.4 浸出物得率和纯度计算 精密量取各试验中所用初始药液和醇沉后药液各 10 ml,置已干燥恒重的蒸发皿中,水浴蒸干后置 105℃干燥箱中干燥至恒重,然后取出,冷却 30 min,迅速精密称重,分别得初始浸膏质量和醇沉后浸膏质量,每个试验样品平行测定 3份,取平均值,计算浸出物得率和纯度。

2.5 单因素试验 以 HSYA转移率为评价指标,分别考察了终点乙醇质量分数、搅拌速度、药液初始质量浓度、醇沉温度和药液 pH等因素对醇沉效果的影响,为正交试验因素水平的选择提供依据。

2.5.1 终点乙醇质量分数对 HSYA转移率的影响 醇沉条件：药液初始质量浓度 1.10 g/ml,搅拌速度 300 r/min,醇沉温度为室温,不调节药液 pH(此时 pH为 4.78),醇沉终点时乙醇质量分数分别为 50%、60%、70%、80%、85%,结果见图 1(A)。结果表明,终点乙醇质量分数在 50%～60%内,HSYA转移率增加,60%时达到最大值,之后随着乙醇的加入,析出的杂质颗粒粒径增大,包裹药液而造成有效成分含量损失,HSYA转移率显著降低,故终点乙醇质量分数宜选择 60%。

2.5.2 搅拌速度对 HSYA转移率的影响 醇沉条件：药液初始质量浓度为 1.10 g/ml,醇沉温度为室温,不调节药液 pH,终点乙醇质量分数 60%,搅拌速度分别为 100 r/min、300 r/min、500 r/min、700 r/min和 900 r/min。图 1(B)显示,随着搅拌速度的增大,HSYA转移率先增大后减小。因为搅拌速度过小,乙醇分布不均匀,导致高质量分数乙醇部分有效成分损失增加;而搅拌速度过大,析出的杂质颗粒受到撞击力过大而黏附在烧杯壁上,黏附的杂质易包裹药液造成有效成分损失,故搅拌速度宜选择500 r/min。

2.5.3 药液初始质量浓度对 HSYA转移率的影响 醇沉条件：醇沉温度为室温,搅拌速度500 r/min,不调节药液 pH,终点乙醇质量分数60%,药液初始质量浓度分别为 1.00 g/ml、1.05 g/ml、1.10 g/ml、1.15 g/ml。由图 1(C)可知,在试验条件下,HSYA转移率随药液初始质量浓度的增大而增大,但转移率增速逐渐变慢,当药液初始质量浓度高于 1.10 g/ml时,转移率增速不明显,故本实验药液初始质量浓度宜选择 1.10 g/ml。

2.5.4 醇沉温度对 HSYA转移率的影响 醇沉条件：药液初始质量浓度 1.15 g/ml,搅拌速度 500 r/min,不调节药液 pH,终点乙醇质量分数 60%,低温恒温槽调节温度分别为 5℃、10℃、15℃、20℃和 25℃。图 1(D)显示,醇沉温度对 HSYA转移率影响不大,考虑到降低能耗和简化操作,选择室温为适宜的醇沉温度。

2.5.5 药液 pH对 HSYA转移率的影响 醇沉条件：药液初始质量浓度 1.15 g/ml,醇沉温度为室温,搅拌速度 500 r/min,不调节药液pH,终点乙醇质量分数 60%,调节 pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和 9.0。图 1(E)表明 ,随着药液 pH的增大,HSYA转移率逐渐降低,故药液 pH宜选择 4.0。

2.5.6 单因素影响程度的比较 单因素实验结果表明,终点乙醇质量分数、药液初始质量浓度和药液 pH这 3个因素对 HSYA转移率的影响比较明显;然后是搅拌速度,而醇沉温度对HSYA转移率影响小。计算各因素对 HSYA转移率影响的极差,按从大到小依次为：终点乙醇质量分数 ＞药液初始质量浓度 ＞药液 pH＞搅拌速度 ＞醇沉温度。

2.6 正交试验

2.6.1 因素水平的选择 在单因素试验结果的基础上,选择终点乙醇质量分数 (A)、药液初始质量浓度 (B)、药液 pH(C)以及搅拌速度(D)4个影响相对较大的因素,按四因素、三水平进行 L9(34)正交设计法 (表 1)。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levelsof orthogonal test

2.6.2 多指标综合评分[7]中药醇沉工艺,应在保证主要有效成分保留率的前提下,尽可能多的提高纯度以及其它药用成分的含量。因此,本实验以 HSYA转移率、浸出物得率和纯度为指标,利用综合加权评分法确定最佳醇沉条件。评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化,再给出不同的权重。具体权重为：HSYA被认为是红花的主要有效成分,故设HSYA转移率权重系数为 0.5,浸出物的量用以代表红花醇沉液中所有组分的量,包括 HSYA和其他有效成分,故将浸出物得率的权重系数设为 0.3,将纯度的权重系数设为 0.2。

2.6.3 最佳醇沉条件的选择 由表 2知,在所选的因素水平范围内,各因素对综合评分的影响程度从大到小依次为：A＞B＞D＞C,最优的工艺组合为：A1B3C3D3。方差分析结果表明,终点乙醇质量分数 (A)和药液初始质量浓度(B)对综合评分有显著性影响 (P＜0.05),因此这 2个因素的最优水平分别为 A1和 B3。由于药液初始 pH为 4.78(接近 5.00),而该因素对综合评分的影响没有显著性,因此最优水平为 C2,即 5.00,为简化操作,也可选择不调节药液 pH。由于搅拌速度对综合评分的影响也没有显著性差异,从节能角度考虑,搅拌速度越小越好,但为了保证药液和混合均匀,避免局部乙醇质量分数过高引起有效成分包裹损失,选择搅拌速度 500 r/min,与单因素试验结果一致。综合得出,红花提取液最佳的醇沉工艺为终点乙醇质量分数 50%,药液初始质量浓度 1.15 g/ml,搅拌速度 500 r/min,药液 pH 5.00。为进一步考察优选工艺的可靠性,保证工艺稳定可行,按上述最佳提取工艺进行 3次验证实验,得 HSYA平均转移率为 94.5%,RSD 0.95%;上清液中浸出物平均得率为 23.3%,RSD 1.98%;上清液固形物中HSYA平均纯度为 66.9%,RSD 1.69%。验证试验结果表明,优选工艺稳定可靠。

表2 正交试验结果分析Table 2 Analysisof the results of the orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Analysisof variance

3 讨 论

本实验优选的红花提取液最佳醇沉工艺为：终点乙醇质量分数 50%,药液初始质量浓度 1.15 g/ml,搅拌速度 500 r/min,药液 pH 5.00。在此工艺条件下,不仅有效成分转移率和浸出物得率较高,而且纯度 (66.9%)也较传统的大孔树脂纯化工艺 (30.5%)大大提高。验证试验结果表明,优选的工艺稳定可靠。

研究表明[8]搅拌速度对醇沉过程颗粒形态结构、运动过程均有较大影响,而沉淀的形态结构与有效成分的保留关系密切,故将搅拌速度作为单因素试验考察因素之一。初始质量浓度过高的药液黏稠度高,难以与乙醇充分接触,析出的沉淀易包裹药液而造成有效成分损失;初始质量浓度过低则药液量大,耗费乙醇,延长时间。因此要将药液浓缩到一定质量浓度后再进行醇沉。有文献报道[9]HSYA受热反应可能有水分子参与,因此醇沉温度选取了低于常温(25℃)进行考察,防止 HSYA发生变化。再结合预实验结果,选择了终点乙醇质量分数和药液 pH作为单因素试验的其它两个考察因素。

应用多指标综合评分法设置指标的权重,需要根据具体情况具体分析。一般来说,在指标成分明确的前提下,浸出物得率越高则纯度越低,但如果有多种有效成分,且部分成分不明确,以浸出物多少来代表总有效成分时,浸膏得率的权重系数应相应增大,并设为正权重系数,纯度的高低则反映某一主要指标成分在总有效成分中所占的比例,设为正权重系数。

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Optimization of alcohol precipitation process for extract of Carthamustinctorius by multiple guidelines grad ing method

YUAN Jia,L IYe-rui,CHEN Yong,WANGLong-hu,L IU Xue-song
(College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Objective：To investigate the optimal alcohol precipitation parameters for extract of Carthamus tinctorius.Methods：The effects of different factors on the transfer rate of hydroxy safflower yellow A(HSYA)was studied via single factor experiments,including the final alcohol concentration of the liquor,the speed of stirring,the initial density of the extract,the temperature and the pH of the liquor.Based on the results of single factor experiments,the final alcohol concentration of the liquor,the speed of stirring,the initial density of the extract and the pH of the liquor were studied by an orthogonal test and a multiple guidelines grading method,and the transfer rate of HSYA,the yield and the purity of extract in the supernatantwere used as comprehensive evaluation index.Results：The op timal alcohol precipitation processof Carthamus tinctorius extractwas as follows：the final alcohol concentration of the liquor 50%,the speed of stirring 500 r/min,the initial density of the extract 1.15 g/ml and the pH of the liquor 5.0.Conclusion：The proposed alcohol precipitation process isconvenient and steady with high transfer rate of HSYA,high yield and purity of extract in the supernatant.

Carthamus tinctorius/isol;Precipitation;ORTHOGONAL test;PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY(TCD)/methods

R 284.2

A

1008-9292(2011)01-0027-06

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2011.01.006

2010-09-15

2010-11-16

浙江省自然科学基金 (Y2080704);国家自然科学基金.

袁 佳 (1987-),女,硕士生.

刘雪松 (1973-),男,博士,副教授,主要从事中药醇沉工艺的研究;E-mail：liuxuesong@zju.edu.cn

[责任编辑 黄晓花 ]