灵芝孢子粉多糖的PMP-HPLC指纹分析*

王浩豪，戴军，陈尚卫，朱松

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

灵芝［Ganoderma lucidum(leyss．ex．fr．)karst］是真菌门，担子菌纲，多孔菌科，灵芝属的真菌，是我国传统的食药两用真菌［1－2］。广义上的灵芝包括灵芝属的所有种类，狭义上则指最常见的赤芝品种［3］。灵芝孢子(Ganoderma lucidumspore，一般来源于赤芝)是其子实体成熟期从菌盖弹射出来的灵芝种子，凝聚了灵芝的精华。由于现代科学研究证实灵芝确具有显著的抗衰老、抗肿瘤、降血糖、免疫调节等多种生理功效［4－9］，加之我国悠久的灵芝文化传承，故近年来有关灵芝及灵芝孢子粉的研究和市场开发十分火热。但因缺乏科学有效的检测方法和质量标准，大量人工培育生产的灵芝孢子粉、子实体和菌丝体及其加工产品的质量良莠不齐，难以对其进行有效控制和鉴别［10－13］。因此，本文拟针对灵芝孢子粉的主要功效成分——多糖类物质，根据其部分水解产物与组成及结构相关(组成及结构又与其活性和质量相关)的思路和多糖大分子难以直接高效分离和检测的特点，首次采用部分酸水解耦合柱前PMP衍生化－反相HPLC［14］分析方法检测和表征其特性，通过若干有代表性的不同来源的灵芝孢子粉及其他不同部位和不同品种的灵芝类样品中多糖组分的指纹分析研究，构建了灵芝孢子粉多糖的HPLC标准指纹图谱，比较了不同部位和不同品种的灵芝类样品中多糖组分的指纹特征及差异，以期用于实际样品的质量监控和鉴别检测。

1 实验部分

1． 1 仪器与试剂

1．1．1 仪器

Agilent1100液相色谱系统，全自动进样器，二极管阵列检测器(DAD);Agilent1100色谱工作站。

1．1．2 试剂及样品

单糖标准品:葡萄糖(Glc，99%)、甘露糖(Man，99%)、半乳糖(Gal，≥99%)，均购于上海化学试剂公司;鼠李糖(Rha，≥99%)、岩藻糖(Fuc，≥99%)、葡萄糖醛酸(GlcUA，≥99%)、半乳糖醛酸(GalUA，≥97%)，均为美国 Sigma-Aldrich公司产品;木糖(Xyl，98%)、氨基葡萄糖(GlcN，98%)、氨基半乳糖(GalN，99%)，均为美国 ACROS ORGANICS公司产品;核糖(Rib，＞99．0%)、阿拉伯糖(Ara，99%)，均购于厦门星隆达生化试剂有限公司。衍生化试剂:1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮(PMP)，纯度99%(美国Acros Organics公司);乙腈，HPLC级(美国 Tedia公司);三氟乙酸(TFA)，纯度不低于99%(国药集团化学试剂有限公司)。水，超纯级;其它试剂均为分析纯。

灵芝孢子粉样品:15个批号分别采自山东、安徽、福建、吉林、湖北、浙江等不同产地。

1． 2 实验方法

1．2．1 灵芝孢子粉多糖的提取

准确称取破壁灵芝孢子粉样品2g于250 mL三角瓶中，加入150 mL超纯水，于水浴70℃超声50 min(功率300 W)，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将2次上清液合并，超纯水透析24 h，55℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至10 mL，待测。

1．2．2 多糖部分酸水解

吸取500μL上步所得的粗多糖水溶液于5 mL的具塞刻度试管中，加入500 μL的0．5 mol/L三氟乙酸(TFA)，充N2封管，沸水浴100℃水解1 h;冷却后打开盖，真空干燥或加入等体积甲醇后用N2吹干，以去除TFA，再加1 mL超纯水溶解水解产物，备用。

1．2．3 PMP 衍生化

取水解后的样品液(或混合单糖标液，各单糖质量浓度均为0．3 g/L 左右)100μL，与100μL 0．6 mol/L的NaOH溶液混匀。取其混合液50μL于5mL具塞试管中，再加50μL 0．5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，同样在70℃的烘箱中反应100 min，取出放置冷却至室温;加60μL 0．3 mol/L的HCl中和，加水至1 mL，再加等体积1mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0．45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

1．2．4 色谱条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm ×4．6 mm i．d．，5μm;流动相:0．1 mol/L 磷酸盐(pH 6．7)缓冲液-乙腈 (体积比为82∶18);柱温:30℃;检测波长:245 nm;流速:0．8 mL/min;进样体积:50μL。

2 结果与讨论

2． 1 方法学考察

2．1．1 糖对照品分析

灵芝孢子粉多糖部分酸水解后产生较多的单糖组分(见表1和图2)，为定性指纹图谱中这些单糖峰，选取天然多糖中常见的12种单糖制备成混合标准溶液，进样分析得到色谱图见图1。由图1可见，12种单糖分离较好，完全能满足指纹图谱定性要求。

图1 12种单糖-PMP衍生物的HPLC图谱

2．1．2 稳定性试验

取经提取、水解和衍生化处理后的13号灵芝孢子粉多糖样品溶液在室温下保存，分别于0，5，10，15，20，25h测定，对各共有峰的相对保留时间(以葡萄糖的保留时间为参照)和相对峰面积(占总峰面积百分比)进行统计。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD＜3%，表明灵芝孢子粉多糖的指纹图谱稳定性试验符合要求。

2．1．3 仪器精密度

取经提取、水解和衍生化处理后的13号灵芝孢子粉多糖样品溶液，连续进样5次，对各共有峰的相对保留时间(以葡萄糖的保留时间为参照)和相对峰面积(占总峰面积百分比)进行统计。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD＜3%，表明灵芝孢子粉多糖的指纹图谱精密度试验符合要求。

2．1．4 方法重复性

分别准确称取13号灵芝孢子粉样品5份，按照上述提取、水解和衍生化方法平行处理样品，并在同样的上述色谱条件下进行HPLC分析，对各共有峰的相对保留时间(以葡萄糖的保留时间为参照)和相对峰面积(占总峰面积百分比)进行统计。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明灵芝孢子粉多糖的指图谱重现性试验符合要求。

2． 2 灵芝孢子粉多糖的标准色谱指纹图谱

取各供试品溶液50μL，注入高效液相色谱仪，记录1h的色谱图。以葡萄糖的峰为参照峰(S峰)，计算相对保留时间和相对峰面积，见表1。

表1 灵芝孢子粉多糖部分酸水解产物的PMP衍生物特征峰的相对保留时间和相对峰面积范围

根据15批供试品溶液HPLC谱给出的相关参数，比较供试品谱图，其中19个峰是各批供试品所共有的，因此确定19个峰为共有指纹峰，且共有峰总面积占总峰面积的95%以上。在共有指纹峰中，2号、15号(s峰)、16号和19号峰的峰面积大于总峰面积的5%(见表1)。各共有峰均按其相对保留时间定性，可知图1中2号、7号、8号、10号、14号、15号、16号、17号、18号、19号峰分别为甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖，12号峰为二糖，3号、9号峰为三糖。

将色谱图谱数据导入指纹图谱专用软件中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版(见图2)。以批号为1的药材的指纹图谱作为参照谱图，以中位数法生成15批药材的对照用指纹图谱，得到灵芝孢子粉多糖的标准色谱指纹图谱，见图3。

图2 15个灵芝孢子粉多糖样品的HPLC图谱

图3 灵芝孢子粉多糖样品的HPLC标准指纹图谱

2． 3 15个灵芝孢子粉多糖样品色谱指纹图谱的相似度评价结果

运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对15批灵芝孢子粉多糖的指纹图谱进行分析，通过相似度评价结果可以发现，同一产地不同批次产品间的相似度较高，大于0．97;不同产地产品间的相似度较低，但仍然大于0．8。

2． 4 不同部位及不同品种灵芝多糖样品与灵芝孢子粉标准指纹图谱的比较

用同样的方法对不同部位及不同品种灵芝多糖样品进行分析后，得到它们的PMP-HPLC图谱，见图4。将它们与赤芝孢子粉多糖的标准指纹图谱相比较，可以发现有显著差别:赤芝子实体多糖图谱4(a)中木糖和阿拉伯糖的相对峰面积均大于总峰面积的11%，而标准指纹图谱中这2个峰的峰面积在0．5%～5%左右。紫芝孢子粉多糖图谱4(b)中葡萄糖峰的相对峰面积大于总峰面积的65%，与灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱显著不同。紫芝子实体多糖图谱4(c)与灵芝孢子粉多糖的标准指纹图谱相比，共有特征峰个数明显不足。这些结果表明，不同部位及不同品种的灵芝类产品的指纹图谱特征会有较大的差异，这些差异可作为区别赤芝孢子粉与其他不同部位及不同品种的灵芝产品的主要依据之一。

图4 不同部位及不同品种灵芝样品的多糖PMP-HPLC图谱

3 结论

首次利用部分水解耦合PMP/RP-HPLC的分析技术，从糖组成、特征水解片段的结构特性角度，对灵芝多糖进行检测和表征，通过15个不同来源的有代表性的灵芝孢子粉样品中多糖组分的指纹分析，构建了灵芝孢子粉多糖的HPLC指纹图谱。此指纹分析方法稳定可靠，重复性好，可作为灵芝孢子粉质量标准的主要依据之一，应用于质量监控。

灵芝孢子粉样品的相似度评价结果显示:同一产地不同批次产品间的相似度较高，大于0．97;不同产地产品间的相似度较低，但仍然大于0．8。此特征可用于灵芝孢子粉的产地来源鉴别。

对灵芝孢子粉与其他不同部位和不同品种的灵芝类样品中多糖组分的指纹分析及比较的结果表明，不同部位及不同品种的灵芝类产品的指纹图谱特征呈现较大的差异，这些差异可用于赤芝孢子粉与其他不同部位及不同品种的灵芝产品的鉴别与掺混检测。

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