直投式酸奶发酵剂中双歧杆菌的分离

陈杰，孙翠焕，吴英春，陈丽媛，冯华，徐冲

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000)

双歧杆菌(Bifidobacterium)是Tissier博士从母乳喂养婴儿的粪便中分离得到的一种专性厌氧、无运动性、无芽孢、无鞭毛及荚膜的革兰阳性杆菌［1］，末端常分叉故名双歧杆菌［2］，是人和动物肠道的重要生理性有益菌。近年来，双歧杆菌对人体的健康作用研究越来越多，含有双歧杆菌的发酵乳制品、肠道微生态制剂等产品已经在相关领域占有一席之地。双歧杆菌在肠道能合成B族维生素及氨基酸，促进钙、铁的吸收;可保持肠道正常微生物菌群平衡，增强机体的非特异性和特异性免疫反应，降低血清胆固醇水平，有防癌抗癌、控制内毒素血症的作用［3］，其功能越来越受到人们的重视。本文介绍一种简便的分离方法，针对直投式发酵剂中双歧杆菌进行菌种分离，从中分离生产性能优良的双歧杆菌，作为出发菌株，供企业技术人员及科研人员研究参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料进口直投式酸奶发酵剂，标注为双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌的混合冻干菌粉。

1.1.2 培养基［4］①WR1培养基(%)：酪蛋白胨1，牛肉膏0.5，酵母膏0.5，葡萄糖0.5，番茄6，丙酸钠1，Na2S·9H2O 0.05，NH4Cl 0.1，MgSO4·7H2O 0.01，L-半胱氨酸0.05，刃天青0.000 1，pH 7;②WR2培养基(%)：大豆蛋白胨1，酵母膏1，葡萄糖1，山梨酸0.04，刃天青0.000 1，胡萝卜汁5，盐溶液4，L-半胱氨酸0.05，pH 7;③WR3培养基(%)：水解酪蛋白1，牛肉膏0.5，酵母膏0.5，葡萄糖1，LiCl 0.3，K2HPO40.05，KH2PO40.04，番茄汁5，维生素C0.3，L-半胱氨酸0.05，pH7;④酸化MRS培养基，调整pH 5.1;⑤M17培养基;⑥MRS培养基。

1.1.3 仪器设备CO2培养箱，恒温培养箱，超净工作台，显微镜，高压灭菌锅。

1.2 方法

1.2.1 直投式发酵剂的菌种活化无菌条件下取少许菌粉转入WR1液体培养基中，轻摇使菌粉融解，注意尽量避免空气进入。分别吸取上述菌液按4%(体积比)接入WR1、WR2、WR3 3种液体培养基中，轻摇使均匀。于CO2培养箱中37℃恒温培养16 h，CO2浓度为20%。同样操作，将菌液接入MRS液体培养基中，37℃恒温有氧培养16 h。镜检观察菌体生长情况。

1.2.2 平板划线分离双歧杆菌根据菌种活化结果，在WR1、WR2、WR3中选择双歧杆菌生长良好的培养基作为分离用平板培养基，以对应培养液中活化的菌体作出发菌株，进行划线培养。37℃恒温培养48～72 h，CO2浓度20%。同样操作，将MRS中活化的菌体分别在酸化MRS和M17培养基平板划线，37℃恒温有氧培养48～72 h。各做3个重复。观察菌落生长情况。

1.2.3 双歧杆菌的初步鉴定［1，3，5］①观察菌落形态及显微镜观察菌体形态;②对菌体进行革兰染色，双歧杆菌为革兰阳性菌;③生长的气体环境：挑取少许双歧杆菌于最适培养基平板划线，分别在CO2浓度为0%、5%、10%、15%、20%条件下37℃恒温培养48～72 h，各做3个重复，观察菌落生长情况;④生长温度试验：挑取少许双歧杆菌于最适培养基平板划线，分别在20、37和46.5℃下培养48～72 h，CO2浓度为20%，各做3个重复，观察菌落生长情况。

1.2.4 培养液中菌体计数方法吸取1 mL培养液，加无菌水23.5 mL，0.3%亚甲基兰染液0.5 mL，用血球计数板在显微镜下计数。

2 结果与分析

2.1 直投式发酵剂的菌种活化

以WR1、WR2、WR3、MRS液体培养基为活化培养基，结果见表1。

表1 菌体活化情况Table 1 Activation of thallus

由表1可知，WR1、WR2、WR3培养液中均有3种菌生长，MRS培养液中有2种菌生长。从菌体形态可初步认定，菌1为嗜热链球菌。分析菌2和菌3，根据菌体的大小、菌体形态、甲基兰染色等特性，初步认定菌2为德氏乳杆菌保加利亚亚种，菌3为双歧杆菌［1，3］。但还要经过生理生化试验才能做最后结论。本文只对杆菌做进一步研究。菌3在培养基WR1中生长状况好于其他3种，且综合考虑菌1和菌2被抑制生长的情况，应选择WR1做为进一步试验用培养基。在MRS培养液中，只有菌1和菌2生长，根据经验，可用酸化MRS和M17培养基的琼脂平板划线法分离嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种。

2.2 平板划线分离双歧杆菌

依据表1结果，选择WR1作为平板划线分离双歧杆菌的最佳培养基。本试验可同时分离嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种。各培养基平板上单菌落形态及显微镜检查结果见表2。由表2可知，在WR1平板上的单菌落a的形态与菌体状态符合对双歧杆菌的描述［1］。从菌落b和c的描述中，初步确定b为德氏乳杆菌保加利亚亚种，c为嗜热链球菌。但酸化MRS和M17分别是二者的选择培养基，在其平板上生长的单落更进一步验证了菌种的可能性。2菌种分别在MRS和M17斜面培养基上培养保存。如有需要，可依据二者的生理生化特点分别进行鉴定。本文在此不再讨论。

表2 菌落检出情况Table 2 Detection of colony

2.3 双歧杆菌的初步鉴定

2.3.1 菌落形态及菌体形态菌落形态及菌体形态观察结果见表2，均符合对双歧杆菌的描述。

2.3.2 其他鉴定项目结果结果见表3。

表3 菌种鉴定情况Table 1 Identification of culture

从表3结果看出，试验菌在37℃培养，CO2浓度低于5%时不生长，高于10%则随着CO2浓度增加菌体生长旺盛，属于厌氧菌。试验菌在20%CO2浓度下，20℃和46.5℃均不生长，而在37℃生长旺盛。根据生理生化特性，从以上鉴定结果可初步确定，所分离的杆菌为双歧杆菌。

3 讨论

从本次分离试验中发现，双歧杆菌的选择性培养基并没有完全抑制嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长。在查阅的相关资料中也有报道，当双歧杆菌被其他厌氧菌明显超过时，双歧菌的选择分离问题尚未完全得到解决。在直投式酸奶发酵剂中，嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种2种兼性厌氧菌活力旺盛，可能影响了双歧杆菌的纯菌分离，试验结果与资料报道相符。另有原因可能是进口直投式酸奶发酵剂中的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种本身是生产性能优良菌株，对某些抑制剂有抗性，可能会出现上述结果。这些问题将在以后的工作中做深入研究。

［1］ 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法［M］.北京：中国轻工业出版社，1999.

［2］ 吕志勇，吕志刚.双歧杆菌的保健功能及其产品研发［J］.安徽农业科学，2006，34(19)：5031-5032.

［3］ 郭本恒编著.益生菌［M］.北京：化学工业出版社，2004.

［4］ 马钢.酸奶及其饮料中双歧杆菌分离培养与计数［J］.食品科学，1994，11(1)：51-52.

［5］ R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册(第8版)［M］.北京：科学出版社，1984.