长效和短效NO发生剂体内干预疟原虫红内期重要侵袭分子转录水平的观察

郑丽，李银燕，刘军，潘艳艳，李莹，延娟，曹雅明*

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳110001;2.中国医科大学附属第一医院超声科，辽宁沈阳110001)

疟疾是疟原虫经媒介按蚊传播的严重威胁人类健康的寄生原虫感染性疾病。疟原虫裂殖子快速识别并入侵适宜其发育的宿主红细胞的侵袭过程是一个复杂的多蛋白参与并有序协调合作的过程［1］。裂殖子借助其表面蛋白家族(MSPs)成员，顶端复合体表面抗原-1(AMA-1)以及棒状体内含有的多种蛋白(RhopH complex)完成疟原虫黏附、侵入红细胞这一复杂过程［2-4］。由于红内期各蛋白在侵袭过程中暴露于宿主免疫系统，所以它们是发病阻断疫苗理想的候选抗原，也因此成为近年来国内外学者研究的热点课题。一氧化氮(nitric oxide，NO)作为非特异性免疫效应分子，在抗多种病原生物感染的过程中发挥着重要的防御作用［5］。前期的研究结果显示NO是控制和消除红内期虫体血症的重要免疫效应分子［6-7］。NO通过细胞毒效应可明显抑制感染人类和啮齿类的红内期原虫的生长及发育［8-9］。同时，NO还可通过抑制感染恶性疟原虫的红细胞对微血管内皮细胞的黏附保护易感宿主［10］。由此推测，NO可能通过某种机制改变疟原虫与宿主红细胞间的相互作用有关，从而减弱疟原虫裂殖子的致病力，然而NO这种影响侵袭力的分子机制目前尚不清楚。本研究通过NO长效和短效发生剂体内对致死型约氏疟原虫进行处理，探讨NO对介导裂殖子黏附、侵入红细胞的关键分子MSP-1、AMA-1和RhopH complex转录水平的影响，以期明确宿主与寄生虫相互作用的本质特征和宿主抗疟原虫保护性免疫的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物6～8周龄雌性BALB/c小鼠(中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号：SCXK6京2004-0001)。

1.1.2 主要试剂NOC5(347-06881，和光纯药工业株式会社，半衰期25 min);NOC18(344-06911，和光纯药工业株式会社，半衰期18 h);TRIzolⓇReagent：invitrogen产品;SYBRⓇPrime-ScriptTMRT-PCR Kit试剂盒(TaKaRa，日本)。

1.1.3 主要仪器PCR仪(pTC-200，peltierThermalCyeler);ABI PRISM 7900 HT(USA)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物感染与NO发生剂体内处理30只雌性，6～8周龄BALB/c小鼠，每只经腹腔感染1×106P.y17XL寄生的红细胞(日本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠)，小鼠随机分为3组，第1组单纯感染对照组(10只);第2组NOC18 25 mmol/L处理组(10只);第3组NOC5 25 mmol/L处理组(10只)。感染后第2天，第2组小鼠尾静脉注射25 mmol/L NOC18，每只小鼠100 μL，每隔20 h注射1次，连续注射3次。感染后第6天第3组小鼠腹腔注射25 mmol/L NOC5，每只小鼠100 μL，30 min后处死小鼠。感染不同时间的小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。

1.2.2 成熟裂殖体纯化心脏取血采集P.y17XL感染的BALB/c小鼠感染血液(感染率达60%～80%)，与等倍PBS混合后通过灭菌纤维素CF11除去白细胞，以50%Percoll(体积比)分离、收集。细胞计数板计数裂殖体数量。取1×108个裂殖体储存于1 mL Trizol中，-20℃保存，供总RNA提取。

1.2.3 Real-time PCR检测NO发生剂体内处理MSP-1、AMA-1和RhopH complex转录水平①PCR引物：利用引物设计软件Primer5设计约氏疟原虫β-actin、MSP-1、AMA-1和RhopH complex特异性引物(表1);②实时定量PCR检测：采用TRIZOL一步法提取疟原虫总RNA，并经紫外分光光度仪检测纯度，RNA A260/A280比值在1.8～2.0之间;按照TaKaRa SYBRⓇPrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒步骤以总RNA为模板进行cDNA合成，反应体积20 μL(5×PrimeScriptTMBuffer 4 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Total RNA 1 μg，反应体积用RNA free H2O补至20 μL);反应条件：37℃15 min，85℃5 s，Real time PCR扩增反应采用SYBR Green I嵌合荧光法反应，反应体积20 μL(SYBRPremixExTapTM(2×)10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL，模板(cDNA溶液)0.2 μL，ddH2O 7.8 μL);反应条件：95℃30 s预变性，95℃5 s，60℃30 s反应40个循环。并检测融解曲线;③实验结果分析：反应结束确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，以β-actin值为内参，通过2-△△CT计算表达倍数。

表1 用于实时定量PCR扩增的引物序列Table 1 The primer sequences for real-time PCR

1.2.4 统计学处理应用SPSS 11.5统计学分析软件，单因素方差分析比较各组均值的显著性差异，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 长效和短效NO发生剂处理后约氏疟原虫AMA-1转录水平的变化

图1 NOC18和NOC5处理后疟原虫AMA-1转录水平的变化Fig.1 The transcription levels of AMA-1 after NOC18 or NOC5 treatment

如图1所示，P.y 7XL感染BALB/c小鼠过程中，疟原虫顶端膜分子抗原AMA-1转录水平存在差异。与NO未处理组相比长效NO发生剂NOC18处理后未见AMA-1转录水平受到影响，而短效NO发生剂NOC5处理后可见AMA-1分子的转录水平下调，并具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 长效和短效NO发生剂处理后约氏疟原虫MSP-1转录水平的变化

通过NO发生剂体内处理P.y17XL感染小鼠可见MSP1转录水平受到一定程度的影响。如图2所示，与NO未处理组相比长效NO发生剂NOC18处理后可见MSP-1转录水平上调，而短效NO发生剂NOC5处理后可见MSP-1分子的转录水平下调，两者均具有统计学意义(P＜0.05)。

图2 NOC18和NOC5处理后疟原虫MSP-1转录水平的变化Fig.2 The transcription levels of MSP-1 after NOC18 or NOC5 treatment

2.3 长效和短效NO发生剂处理后约氏疟原虫RhopH complex转录水平的变化

图3 NOC18和NOC5处理后疟原虫RhopH complex转录水平的变化Fig.3 The transcription levels of RhopH complex after NOC18 or NOC5 treatment

通过长效或短效NO发生剂体内处理P.y17XL感染小鼠可见RhopH complex转录水平受到一定程度的影响。如图3所示，与NO未处理组相比长效NO发生剂NOC18处理后未见RhopH complex转录水平受影响，而短效NO发生剂NOC5处理后可见RhopH complex分子的转录水平下调，并具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

在疟原虫的各生活周期中，裂殖子期原虫破裂宿主红细胞和重新入侵的周期性过程是宿主寒战、发热和贫血等一系列疟原虫感染后病理症状产生的基础［11］。红内期循环启动的关键点是裂殖子快速识别并入侵适宜其发育的宿主红细胞。与大多数具有顶端复合体结构的原虫(如弓形虫)相似，形成于红内期晚期的顶端结构可通过释放其内部特异性分泌器官—棒状体、微线体和致密颗粒帮助裂殖子侵袭宿主红细胞。其中，棒状体和微线体在裂殖子侵袭过程中分泌大量侵袭相关蛋白。这些蛋白或释放于裂殖子表面，或进入宿主红细胞内部，在这些部位，它们帮助裂殖子在极短的时间内(＜60 s)完成对宿主细胞的识别，配-受体连接，入侵激活以及侵入后纳虫泡的形成。由于顶端复合体内的各蛋白在侵袭过程中暴露于宿主免疫系统，所以它们是发病阻断疫苗理想的候选抗原。也因此成为近年来国内外学者研究的热点课题［12-13］。

MSP-1、AMA-1和RhopH complex是疟原虫红内期表达的关键蛋白，在疟原虫侵入过程中发挥重要作用。通过MSP-1、AMA-1和RhopH complex为抗原诱导的抗体对疟原虫入侵红细胞均具有一定抑制作用［14-17］。前期的研究结果显示，应用NO发生剂(NOC5或NOC18)体外处理疟原虫成熟裂殖体后，裂殖子对红细胞的侵袭能力显著减弱或丧失。而且，NO对裂殖子的抑制效应呈明显的时间和剂量依赖性［18］。尽管NO作为非特异性免疫效应分子，在抗肿瘤发生、诱导瘤细胞凋亡和抗菌、抗病毒及胞内寄生性原虫等多种病原生物感染过程中，发挥着重要的免疫介导和防御作用，但是血红蛋白对NO的耗竭具有极强的作用，而顶端复合体内的各蛋白在侵袭过程中暴露于宿主免疫系统下，因此本研究通过实时定量PCR检测了侵袭过程中重要的疟原虫侵袭相关分子MSP-1、AMA-1以及RhopH complex水平。从转录水平看，短效NO发生剂NOC5体内处理P.y17XL感染的BALB/c小鼠，对疟原虫MSP-1、AMA-1以及RhopH complex分子具有明显抑制作用，而长效NO发生剂NOC18则未见这一现象。这一结果推测在DBA/2和BALB/c小鼠感染P.y17XL的鼠疟自然模型里DBA/2在感染早期存在NO短时间的高水平释放，因而对疟原血症有一定控制作用。因此本研究结果提示，宿主体内存在的NO短时间、高水平的释放对宿主控制疟原血症具有一定的作用。

综上所述，NO对疟原虫侵袭相关分子的转录水平有一定影响，通过高剂量、短期的NO干预可影响决定疟原虫侵入的关键蛋白MSP-1、AMA-1以及RhopH complex的转录水平，进而可能影响疟原虫的侵入过程。

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