SN38对Fas介导凋亡效应的影响

曹妍，王欢，童晓鹏，单风平，梅原久範，吕昌龙*

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳110001;2.西藏民族学院免疫学教研室，陕西咸阳712000;3.金沢医科大学血液免疫内科，日本金沢920-0293)

细胞凋亡是在多种基因调控下的一个严密完整的、主动的、有序的死亡过程。Fas(CD95/APO-1)是TNF受体超家族成员，通过与Fas配体(FasL)或者抗Fas抗体(CH11)结合，诱导Fas分子聚集形成三聚体，通过其胞浆内的死亡结构域(death domain，DD)与Fas相关的死亡结构蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)结合，形成死亡受体诱导的信号复合体(DISC)，DISC可以活化caspase分子介导细胞凋亡［1］。伊立替康(Irinotecan)，也称为CPT-11，通过抑制拓扑异构酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，TopoⅠ)选择性杀伤S期细胞。SN38(10-hydroxy-7-ethyl-camptothe-cin)是CPT-11的活性代谢产物，其作用强度至少是CPT-11的1 000倍，并且具有广泛的抗肿瘤谱［2-3］。脂筏是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域(microdomain)。鞘磷脂(sphingomyelin，SM)是脂筏的重要组成成分。最近的一些研究表明，Fas介导的凋亡过程中，Fas可易位和聚集于脂筏所在区域［4］，脂筏通过促进DISC的形成进而活化caspase依赖的细胞死亡途径。因此为深入探讨SN38与Fas介导凋亡的相互关系，本实验通过单独应用SN38或SN38联合CH11(Fas抗体)作用于脂筏阴性和脂筏阳性的T细胞淋巴瘤细胞株WR/Fas-SM(-)细胞和WR/Fas-SMS1细胞，观察SN38能否促进Fas介导的凋亡以及对2种细胞的效应差异，并进一步探讨脂筏在该过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞WR/Fas-SMS1细胞和WR/Fas-SM(-)细胞［5］由日本金沢医科大学血液免疫内科提供。

1.1.2 主要试剂二甲基亚砜(DMSO，SIGMAALDRICH);0.4%台盼蓝(Gibco);碘化丙啶(PI，Invitrogen);多聚甲醛;皂甙;琼脂糖(TAKARA);RPMI-1640培养液500 mL(Gibco，Invitrogen);CH11(Medical＆Biological Laboratories，Japan);Genelute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(Sigma);SN38(Yakult pharmaceutical，Japan)。

1.1.3 主要仪器流式细胞仪，FACSCalibur，美国BD公司;CO2细胞孵育箱，WJ-3，日本Harasawa;倒置显微镜，日本Olympus。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养WR/Fas-SM(-)细胞和WR/Fas-SMS1细胞常规复苏后，培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的1640培养液中，于5%CO2，37℃培养箱内常规传代培养。

1.2.2 细胞处理常规收集并且计数细胞，调整细胞浓度为5×105/mL，接种24孔板，每孔1 mL。CO2细胞孵育箱中培养2 h后，分别加入不同浓度SN38和/或CH11刺激，混匀细胞后，放入CO2细胞孵育箱中继续培养。

1.2.3 形态学观察刺激细胞12 h后，于倒置显微镜下观察，并于放大400倍时拍照记录。

1.2.4 FACS检测细胞凋亡分别收集24孔板中处理后的WR/Fas-SM(-)细胞和WR/Fas-SMS1细胞于1.5 mL微量离心管中，1 200 r/min离心3 min，弃上清，每管加0.5%PFS(0.5%多聚甲醛，0.5%皂甙)100 μL，再加入150 μg/mL RNase A 50 μL。室温放置30 min后，每管加入1 mL PBS，混匀后，1 200 r/min离心3 min，弃上清，每管留50 μL液体，再加入200 μg/mL PI 5 μL，混匀后避光放置15 min。再于每管加入500 μL PBS，待流式细胞仪检测。

1.2.5 DNA ladder检测按照Sigma Genelute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit说明书操作。经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.6 统计学分析应用SPSS11.5统计学分析软件，用t检验进行显著性分析，P＜0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 SN38对WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影响

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1经过不同浓度SN38刺激12 h后，与对照组相比不同浓度SN38均诱导了2种细胞的凋亡现象发生，但在各浓度组，2种细胞之间的凋亡率并无显著性差异，见图1。

2.2 CH11对WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影响

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1经过不同浓度CH11刺激3 h后，50 ng/mL CH11可诱导WR/Fas-SM(-)细胞有意义的凋亡现象，但凋亡率较低;而在25 ng/mL和50 ng/mL 2个浓度组均诱导了WR/Fas-SMS1细胞有统计学意义的凋亡现象，并且在2个浓度组，2细胞之间的凋亡率存在显著性差异，见图2。

图2 CH11作用WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1后凋亡率的比较Fig.2 Comparision of apoptosis between WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 cultured with CH11

2.3 SN38和CH11共同作用对WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影响

图3 SN38单独及与CH11联合应用对WR/Fas-SM(－)细胞凋亡率的影响比较Fig.3 Comparision of apoptosis of WR/FAS-SM(-)cultured with CH11 and/or SN38

SN38和CH11联合应用与SN38单独应用各浓度组相比，WR/Fas-SM(-)细胞凋亡率未见显著性差异(见图3);但对WR/Fas-SMS1细胞，在SN38 50 nmol/L浓度组出现凋亡率的差异(见图4)，并且在该浓度组，2种细胞之间的凋亡率出现了显著性差异(见图5)。

图4 SN38单独及与CH11联合应用对WR/Fas-SMS1细胞凋亡率的影响比较Fig.4 Comparision of apoptosis of WR/Fas-SMS1 cultured with CH11 and/or SN38

图5 SN38和CH11共同作用对WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡率的影响比较Fig.5 Comparision of apoptosis between WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 cultured with CH11 and SN38

2.4 SN38和CH11共同作用后WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1的形态学改变

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1经过SN38和CH11刺激12 h后均出现比较明显的凋亡现象，并且WR/Fas-SMS1细胞的凋亡细胞数量明显多于WR/Fas-SM(-)细胞，见图6(图中箭头所指为凋亡细胞)。

图6 SN38和CH11共同作用对WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1的形态学改变(400×)Fig.6 Morphological changes of WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 after SN38 and CH11 stimulation(400×)

2.5 SN38和CH11共同作用对WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1 DNA降解的影响

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1经过SN38和CH11刺激12 h后，DNA提取结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳的结果表明2种细胞都出现了DNA的断裂片段呈梯状(DNA ladder)排列，并且WR/Fas-SMS1细胞DNA的断裂程度明显强于WR/Fas-SM(-)细胞，见图7。

图7 SN38和CH11共同作用对WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1 DNA降解的影响Fig.7 Degradation of chromosomal DNA in WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 after SN38 and CH11 stimulation

3 讨论

本实验结果显示，联合应用SN38和CH11与单独应用SN38或CH11相比，能够诱导WR/Fas-SMS1细胞更强的凋亡。该结果表明化疗药SN38与CH11联合使用在诱导细胞凋亡作用中具有叠加效应。

脂筏是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域，参与细胞膜的转运、信号传导过程［6］。信号分子(如受体)将在脂筏中与它们的配体相遇，启动信号传递途径［7-8］。目前已经发现，脂筏参与了免疫突触的形成［9］，巨噬细胞的内吞作用［10］，老年痴呆病中淀粉样蛋白的产生［11］等一系列生理和病理过程。鞘磷脂是脂筏的重要组成成分。目前，人们已经成功克隆了2种编码SMS的基因，分别为SMS1和SMS2。本实验中所应用的WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1细胞分别是SMS1缺陷和表达的2株细胞，进而形成了细胞膜脂筏阴性和阳性的2种细胞。最近的一些实验表明，脂筏参与了Fas介导的凋亡过程，尤其是在多发性骨髓瘤［12］和淋巴瘤［13］的发病过程中。

单独应用不同浓度SN38作用于WR/Fas-SM(-)细胞和WR/Fas-SMS1细胞后，各浓度组的凋亡率在2种细胞间均未见显著性差异，且在50 nmol/L浓度的SN38刺激时，相比25 nmol/L浓度并不能诱导出更高的凋亡率;而在SN38与25 ng/mL的CH11共同作用于2种细胞后，观察到在SN38为50 nmol/L时明显诱导了WR/Fas-SMS1细胞更高的凋亡率，而对WR/Fas-SM(-)细胞相同的处理后，并没有该现象的发生。随后的形态学观察和DNA Ladder的实验结果也更加证实了这个结论。由于WR/Fas-SMS1细胞含有人为转入的SMS1基因，因此该细胞膜表面表达SM，而对于WR/Fas-SM(-)细胞，由于SM缺陷，导致细胞膜脂筏功能的缺陷或低下。又由于脂筏参与Fas介导凋亡过程，即参与了Fas与配体结合后，信号向内部的传递［14］，甚至有些实验表明，在细胞膜存在脂筏的情况下，Fas可以在没有Fas配体与其结合的情况下介导细胞凋亡［15］。基于以上结果，可推测脂筏在SN38和CH11共同作用后，2种细胞凋亡率的显著差异中起到了决定性的作用。

综上，SN38和CH11的共同应用能促进WR/Fas-SMS1细胞的凋亡，显示了SN38和CH11在诱导凋亡方面的协同作用。同时，SN38和CH11的共同应用对WR/Fas-SM(-)细胞凋亡的促进不明显，推测脂筏在SN38促进WR/Fas-SMS1细胞Fas介导凋亡作用中起到一定作用。

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