脂肪酸甲酯法检测空心莲子草入侵影响土壤微生物群落结构的初步研究

王志勇，江雪飞，郑慧，方治伟，郑世学*

(1.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室微生物农药国家工程研究中心，湖北武汉430070;2.咸宁职业技术学院，湖北咸宁437100)

空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)，又名喜旱莲子草、水花生、空心苋、水蕹菜、革命草，属苋科(Amaranthaceae)，莲子草属(Alternanthera)，原产南美洲，多年生宿根、草本、水生植物，广泛分布于世界温带及亚热带地区。1892年在我国首次发现，后来迅速蔓延。空心莲子草几乎遍及我国黄河流域以南地区，目前中国除甘肃东南部、宁夏、陕西、山西、内蒙古南部以及辽宁南部尚未遭到入侵外，其他地区均有分布，2003年已被中国科学院、中国环保总局确定为我国第一批外来入侵物种之一［1］。土壤微生物群落是土壤生态系统中最重要的组成部分，它们和地表植物之间存在着非常密切的相互联系和相互影响。土壤微生物的数量巨大、组成极为复杂，目前大约80%～99%的微生物种不可培养或未能得到培养［2］。脂肪酸甲酯(FAME)谱图分析法是鉴于FAMEs可作为生物标记物，通过分析微生物细胞膜上磷脂脂肪酸的组分可以对微生物进行定量、分析微生物多样性和群落结构的变化。该法是不依赖于微生物培养的生物化学方法，在适宜条件下，可用来直接估价微生物的生物量及群落结构，是一种较为全面、准确、快速、直接的研究方法［3］，已有研究者将脂肪酸分析用于评价入侵植物对土壤微生物的影响［4］。目前对空心莲子草入侵机理的研究主要是从植物本身的角度出发，空心莲子草入侵后与土壤微生物之间的相互作用所知甚少。本文采用脂肪酸甲脂(FAME)谱图分析法，结合活菌计数拟研究空心莲子草入侵马尼拉草坪后对土壤微生物群落结构的影响，从而揭示空心莲子草入侵后土壤微生物群落结构的演变状况。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与处理

采样时间为2009年5月。所选采样区分别为咸宁职业技术学院、仙桃职业学院、华中农业大学(表1)。3个采样区同属亚热带季风性(湿润)气候，四季分明;年均气温为15.8～17.5℃，年平均降雨量为1 150～1 450 mm，且较为集中。分别在空心莲子草单一群落区和马尼拉草坪区按5点采样法，采样深度为0～15 cm，土样充分混合后马上风干至湿度为20%～30%，过2 mm筛子，一部分土样立即进行实验，另一部分保存至-80℃备用。土壤有机质、全氮、硝态氮、有效磷、速效钾等主要理化性质见表2。

表1 采样地点的地理位置及样品的编号Table 1 The information of soil sampling sites

表2 空心莲子草入侵对土壤理化性质的影响Table 2 Effects of Alligator weed invasion on soil chemical and physical properties

1.2 方法

1.2.1 活菌计数采用稀释平板计数法测定土壤中的微生物数量。参照《微生物实验》［5］介绍的方法，分别采用牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基(灭菌后加入适量的链霉素)和改良高泽氏1号培养基(灭菌后加入适量的重铬酸钾)培养土壤细菌、真菌和放线菌。细菌、真菌和放线菌分别培养48、72和120 h后计数。

1.2.2 土壤微生物总脂肪酸的提取土壤微生物群落结构的分析采用脂肪酸甲酯谱图分析法。其提取过程:取10 g土样于50 mL离心管中，加入20 mL 0.2 mol/L KOH溶液，涡旋振荡5 min，37℃水浴1 h，每10 min涡旋样品一次;加入3 mL 1.0 mol/L HAc溶液，充分摇匀中和溶液pH值;加入10 mL正己烷，充分摇匀，5 000 r/min，5 min，取上层正己烷相于干净玻璃试管中，氮气吹干，向试管中加入1 mL 1∶1的正己烷-甲基叔丁基醚溶液，充分溶解3～5 min，转入GC小瓶，用于脂肪酸分析［6］。

1.2.3 脂肪酸的测定GC-MS为美国Finnigan Trace GC Ultra和Finnigan Trace DSQ MS检测器。色谱柱为DB-5 MS(15 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气。进样口温度为250℃，流速为1 mL/min。程序升温:40℃，2 min，以30℃/min升到170℃，停留2 min，以2℃/min升至200℃，再以20℃/min升到250℃，停留3 min，整个循环需要28.8 min。离子源温度200℃，溶剂延迟时间为6 min，分流比为50∶1，进样1 μL。脂肪酸含量的测定采用C19:0内标法以峰面积定量，各脂肪酸的含量用μg/g土来表示［4，6-8］。细菌标记脂肪酸是i15:0，a15:0，15:0，i16:0，16:1ω7，17:0，i17:0，a17:0［9］;10Me18:0为放线菌的主要标记脂肪酸［10］;18:2ω6，9和18:1ω9为真菌标记脂肪酸［11］，16:1ω7是丛枝菌根(AM)真菌的主要标记脂肪酸［12］。

1.2.4 统计方法各数据的方差分析、单因素分析、主成分分析(PCA)、数据差异性分析、相关性分析用SPSS 16.0统计软件、Excel软件进行。

2 结果与分析

2.1 入侵前后可培养微生物的变化

可培养细菌、真菌、放线菌的计数统计见表3。

表3 空心莲子草入侵对土壤可培养微生物数量的影响Table 3 Effects of Alligator weed invasion on soil cultivale microorganisms

空心莲子草入侵后各采样区土壤可培养细菌、真菌的数量显著增加;其中咸宁和仙桃两地可培养真菌数量的增加极显著;所有土壤样品可培养放线菌的数量显著下降。

2.2 入侵前后土壤微生物脂肪酸的变化

脂肪酸分析采用了各类脂肪酸的相对含量(各类脂肪酸占土壤总脂肪酸的比例)而不是脂肪酸的绝对含量，这样可有效排除土壤有机碳对结果分析的影响。空心莲子草入侵后对土壤各大类微生物脂肪酸比例的影响见图1。空心莲子草入侵后采自咸宁的土样G+细菌、放线菌的脂肪酸极显著增加，咸宁土样G-细菌、AM真菌、真菌和仙桃土样的G-细菌的脂肪酸均极显著减少。仙桃土样的其他脂肪酸和武汉土样的所有类群脂肪酸变化不显著。空心莲子草入侵后对各类微生物脂肪酸的影响见图2。空心莲子草入侵后不同土壤微生物的各类脂肪酸占土壤总脂肪酸的比例有一定的变化。采自武汉的土样变化均不显著;空心莲子草入侵后采自仙桃的土样中微生物脂肪酸的比例中G-的16:1ω7的含量降低极显著、9cy19:0含量显著降低，其他变化不显著;采自咸宁的土样微生物脂肪酸的比例在空心莲子草入侵后变化较大，其中G+的i15:0、a15:0、i16:0、i1:0、a17:0、17:0，G-的9cy17:0、9cy19:0，放线菌的10Me18:0等均极显著地增大，G+的16:0增大显著，G-的16:1ω7，真菌的(18:2ω6，9)、18:1ω9以及AM真菌的16:1ω5则极显著地降低。以上结果说明，空心莲子草入侵后土壤微生物的群落结构发生了一定程度的改变。

图1 空心莲子草入侵后对各土壤微生物类群的影响Fig.1 Effects of Alligator Weed invasion on soil microflora

2.3 土壤脂肪酸的主成分分析

空心莲子草入侵对土壤各类脂肪酸占土壤总脂肪酸比例的主成分分析见图3。第1主成分对总FAME数据变异的贡献率是46.91%，第2主成分对总FAME数据变异的贡献率是16.25%。第1主成分和第2主成分之和达63.16%，反映了空心莲子草入侵后土壤微生物的大部分信息。空心莲子草入侵前后各土壤脂肪酸在主成分图中所处的位置不同，采自仙桃的土样在主成分分析图中的位置几乎重叠，采自武汉的土样差异也不大，说明空心莲子草入侵后对这两地土壤微生物的影响不大，采自咸宁的土样在图中的位置差异很大，说明空心莲子草入侵对土壤微生物产生了很大的影响，与群落结构分析(图1)和各脂肪酸标记物的变化(图2)相一致。

图2 空心莲子草入侵后对土壤微生物脂肪酸比例的影响Fig.2 Effects of Alligator Weed invasion on proportion of FAMEs of soil microorganisms

图3 空心莲子草入侵后土壤脂肪酸的主要成分分析Fig.3 The plot of PAC of FAMEs in soil microbial community

3 讨论

作为生物标记的脂肪酸的变化可以揭示土壤微生物的变化［7-8］。牛红榜在对紫茎泽兰入侵的研究中采用脂肪酸分析、平板计数等方法得出结论:紫茎泽兰入侵降低了土壤放线菌数量，显著提高了真菌、丛枝菌根真菌的数量，一些土壤其他微生物类群也有改变。进而指出紫茎泽兰在入侵地可能是通过改变土壤微生物群落，提高土壤中具有一定生理功能微生物的类群，进而增强土壤养分循环，活化土壤养分，从而有利于该植物的入侵［4］。本研究中活菌计数和脂肪酸分析均显示空心莲子草入侵前后土壤微生物的类群发生了一定程度的改变，但因地域差异其变化的程度差别较大。因此，空心莲子草入侵引起的土壤微生物群落结构的演替还需要更深入的研究。

微生物是土壤养分转化的重要动力。土壤理化性质的结果(表2)显示空心莲子草入侵后土壤全氮增加、硝态氮显著增加、土壤有机质含量显著增加，土壤其他成分的含量及pH值也有变化，这些结果从另一个侧面说明了空心莲子草入侵后引起了土壤微生物类群的变化，正是由于这种变化导致土壤理化性质发生了一定程度的改变。

［1］ 陈立立，余岩，何兴金.喜旱莲子草在中国的入侵和扩散动态及其潜在分布区预测［J］.生物多样性，2008，16(6):578-585.

［2］ Kirka JL，Beaudettea LA，Hart M，et al.Methods of studying soil microbial diversity［J］.Journal of Microbiol Methods，2004，58(2):169-188.

［3］ 韩雪梅，郭卫华，周娟，等.土壤微生物生态学研究中的非培养方法［J］.生态科学，2006，25(1):87-90.

［4］ Niu HB，Liu WX，Wan FH，et al.An invasive aster(Ageratina adenophora)invades and dominates forest understories in China:altered soil microbial communities facilitate the invader and inhibit natives［J］.Plant Soil，2007，294(1/2):73-85.

［5］ 赵斌，何绍江.微生物学实验［M］.北京:科学出版社，2007.

［6］ 蔡燕飞，廖宗文.FAME法分析施肥对番茄青枯病抑制和土壤健康恢复的效果［J］.中国农业科学，2003，36(8):922-927.

［7］ Ibelwe AM，Kdnnedy AC.Phospholipid fatty acid profiles and carbon utilization patterns for analysis of microbial community structure under field and greenhouse conditions［J］.FEMS Microbiol Ecology，1998，26(2):151-163.

［8］ Ponder FJ，Tadros M.Phospholipid fatty acids in forest soil four years after organic matter removal and soil compaction［J］.Applied Soil Ecology，2002，19(2):173-182.

［9］ Frostegård A，Bååth E.The use of phospholipid fatty acid to estimate bacterial and fungal biomass in soil［J］.Biology and Fertility of Soils，1996，22(1/2):59-65.

［10］ Jennifer MK，Dick RP.PLFA profiling of microbial community structure and seasonal shifts in soils of a Douglas-fir chronosequence［J］.Microbial Ecology，2008，55(3):500-511.

［11］ Zogg GP，Zak DR，Ringleberg DB，et al.Compositional and functional shifts in microbial communities due to soil warming［J］.Soil Science Society of America Journal，1997，61(2):475-481.

［12］ Olsson PA，Thingstrup I，Bååth E.Estimation of the biomass of arbuscular mycorrhizal fungi in a linseed［J］.Soil Biology and Biochemistry，1999，31(13):1879-1887.