五种马病毒基因芯片检测方法的建立

汪 琳 周 琦 柏亚铎 邢佑尚,2 赵胤泽,2 张鹤晓 蒲 静 乔彩霞 蒋 迪 齐玮

(1.北京出入境检验检疫局 北京 100026;2.沈阳农业大学;3.博奥生物有限公司)

1 前言

非洲马瘟[1]是马科动物的非接触性传染病,被世界动物卫生组织列为必须检疫的重大动物疫病。由于该病的巨大破坏性,在国际上进行马的运输过程中,尤其是在无 AHS的地区,必须执行严格的兽医卫生措施。西尼罗病毒[2]于二十世纪九十年代在欧洲和美洲开始暴发,随后在西半球不断蔓延,不仅几乎传遍整个美国,而且还进入到加拿大、墨西哥和西印度群岛等地区,并成为这些地区一个重要的公共卫生问题。2003年 SARS的出现,引起人们对冠状病毒[3]极大的关注。迄今为止,我国尚未发现这些病毒感染的临床病例,但是我国的气候、地理环境复杂,蚊虫种类繁多,具备传播条件,随着国际交流的日益频繁,传入我国境内的可能性非常大。预防病毒意外传入的第一步是检测,由于我国目前尚没有非洲马瘟、西尼罗热等病毒的病原体,长期以来一直无法开展针对这些病毒的系统研究,缺乏对这些可能传入我国的重大传染病的快速、灵敏和特异的诊断技术,一旦发生意外传入和暴发事件将难以应对。因此很有必要利用现代分子生物学技术,在无病原体的情况下建立非洲马瘟病毒、西尼罗热病毒等的检测方法,为防止这些病毒的传入和发生突发感染事件时迅速排查可疑病例、鉴定病原以及采取有效的预防和控制措施提供技术支撑。

基因芯片技术[4]可将大量已知序列的核酸作为探针固定在玻片等载体上,与互补的核苷酸序列杂交,通过芯片杂交信号,判断待检样品中有无可疑病原体,一次试验可得出多条信息,具有快速、高通量、并行处理等优点,在疾病筛查中具有无可比拟的优势。本研究将芯片技术用于五种马病检测中,建立了同时检测五种马病病毒的芯片检测快速筛查技术。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 质粒、宿主菌、病毒及血清

原核表达质粒 PET-30a、大肠杆菌 (E.coli)BL21(DE3)、马鼻肺炎病毒和马动脉炎病毒[5]、待检血清为北京出入境检验检疫局动检实验室保存;非洲马瘟阻断 EL ISA试剂盒 (内含马的 AHSV标准阳性血清和阴性血清)购自西班牙 I NGENASA公司;西尼罗病毒购自美国 Fort Dodge Animal Health公司的灭活疫苗;马冠状病毒克隆质粒引自澳大利亚兽医研究所。

2.1.2 引物、探针序列合成与验证

引物序列:

EAV F-1:TTGTGGTGACGGGATTTTAG EAV R-1::TGTAGCTTGTAGGCTGTCGC

EAV F-2:GGCGACAGCCTACAAGCTAC EAV F-2:CGGCATCTGCAGTGAGTGA

EHVF:ACACGCAGGTCGCTACTAT EHV R:CTCTAGTTGTTTGGCGGTGA

ECV F:CAAACCAGAGGTAGGAGAGC ECV R:GTGCCATACTGGGCTTTAG

WNV F:CACAATGACAAACGTGCTG WNV R:CTTCCTATTGCCTTGGTAGA

AHSV F:GCGATAGCAGCAAGAGCCT AHSV R:GGCCTCATCGATACCGAATGA

每对引物的上游引物的 5’端标记荧光,用于杂交检测。

探针序列:

EAV orf6:AAATGGACCGAAGACGAGG EAV orf7:TCATAAAGAACCGCTGTACG

EHV-4 gB:CGTTTGTGTAGGCGATGTAG ECV N:ATACCAGCGTGGCAACAAT

WNV: TGTCCACCACTCCTTGTCTG AHSV:ACTCTCGCATCTGTCACTGT

人工合成的AHSV病毒片段:

AHSV-1

GCGATAGCAGCAAGAGCCTTGTCCGTTGTACG GGCATGCGTCACAGTGACAGATGCGAG

AHSV-2

TTGCAATCCCTAACGTCTCCATCACTCCTGGAT CCAAGCTAACTCTCGCATCTGTCACT

AHSV-3

CCTCATCGATACCGAATGATTCGTTAAACCATT GTACCTATTAATTGCAATCCCTAACG

2.1.3 主要试剂及仪器

Cy3-dCTP购自 Amersham Biosciences公司 ;芯片、杂交盒、芯片扫描仪 (Luxscan 10k/B)博奥生物有限公司生产,其他化学试剂均为分析纯。

2.2 方法

2.2.1 核酸模板制备

本项目中检测的五种病原体来源不同,扩增模板的制备也不相同。EAV病毒和 EHV-4病毒模板采用MN提取试剂盒提取的 EAV病毒 RNA和EHV-4病毒 DNA;ECV病毒和WNV病毒扩增模板为质粒模板;AHSV为人工合成的核酸片段,先用PCR扩增进行连接,扩增后的产物与 T-载体连接过夜,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。转化后的菌株进行培养和筛选,筛选出的克隆进行测序验证,验证正确的菌株进行质粒提取,提取的质粒用于 PCR扩增。

2.2.2 多重不对称 RT-PCR扩增

本项目需要同时检测马病的五种病毒,因此建立多重不对称 RT-PCR扩增体系。实验中上游荧光标记引物浓度相同,均为 0.2μM,下游引物浓度根据设定的引物比例进行调整。整个反应循环程序分为正常的扩增和高温退火两个阶段。

2.2.3 芯片上探针点阵排布

芯片上点制 2条阴性对照、3条阳性对照和 5条病毒检测探针,每条探针设置三个重复。阴性对照是合成的一段植物基因片段,阳性对照为合成的与靶基因没有同源性的核酸片段,以监控杂交反应是否有效。

2.2.4 芯片杂交反应

芯片杂交液组成成分为:10μL杂交缓冲液 +8μL PCR产物,杂交温度 50℃,杂交时间 2h。杂交后的芯片洗涤后扫描,扫描参数为:激光 Power 90%,PMT 70%。

2.2.5 芯片特异性和灵敏度实验

分别提取马传染性贫血病毒 (EIAV)、马腺病毒I型 (EHV-1)、牛鼻气管炎病毒 (IBRV)、猪胃肠炎病毒 (TGEV)的 RNA,扩增与芯片杂交,验证芯片检测体系的特异性。

对建立的检测体系进行灵敏度评价,实验方法为:对 AHSV、ECV和WNV质粒,EAV和 AHV病毒核酸进行紫外定量,算出浓度 (1A260吸光度值 =ds DNA50mg/mL=ss DNA33mg/mL=ss RNA40mg/mL),根据病毒的分子量算出病毒的拷贝数,然后对提取的核酸溶液进行 10倍系列稀释,用稀释后的核酸溶液做为模板进行多重扩增,扩增后的产物进行芯片杂交,根据杂交结果判断每种病毒的检测下限。拷贝数计算公式:(6.02×1023copies/mol)×(浓度 g/mL)/(MW g/mol)=copies/mL。

2.2.6 芯片检测重复性实验

按照优化好的芯片反应体系,对 5种马病病毒同时检测,进行 3个重复实验,根据扫描结果,验证芯片重复性。

3 结果与讨论

3.1 探针有效性的验证

通过实验筛选杂交信号强,相互无交叉反应的检测探针,最后筛选出了用于五种病毒检测的 5条探针,芯片杂交效果见图 1,用于多重检测体系的建立。

图 1 马病病毒探针验证结果

3.2 特异性验证

分别提取 EI AV、EHV-1、I BRV和 TGEV的RNA,经 RT-PCR和扩增后分别与芯片进行杂交,扫描结果显示,除阳性参照外,其余位点均无杂交信号,说明设计的引物与其他病毒无交叉反应。

图 2 交叉反应实验验证结果

图 3 五种病毒混合杂交反应结果

3.3 芯片检测体系的建立

通过对引物浓度、多重 PCR反应循环数、杂交温度、杂交时间的优化,建立了马病芯片检测体系:上下游引物浓度比例为 5:1,第一步 PCR为 25个循环和第二步 PCR为 15个循环,杂交温度为 50℃,杂交时间为 2h。五种病毒核酸同时与芯片杂交,无干扰现象都能出杂交信号,见图 3所示。

3.4 马病芯片检测灵敏度评价

对建立的检测体系进行了灵敏度评价,实验结果见图 4。

图 4 芯片检测体系各病毒灵敏度评价

杂交结果显示,EAV病毒、ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为 102copies;AHSV质粒样品检测灵敏度为 104copies;EHV-4病毒样品质粒样品检测灵敏度为 103copies。

3.5 芯片检测重复性实验

图 5 芯片杂交检测体系重复性

3.6 进口马全血样品的基因芯片筛查

将马病基因芯片应用于 450份临床马血清的筛查,非洲马瘟、西尼罗热、马冠状病毒全部为阴性,检出 6份马动脉炎病毒阳性,2份马鼻肺炎病毒阳性,与病毒中和试验结果一致。

4 讨论

基因芯片检测方法具有快速、灵敏和高通量等特点,可对多个基因位点的信息进行分析,可最大限度保证检出率。本研究建立的马病芯片检测方法,在一次实验中可同时检测 5种马病毒,将检疫检疫时间由 1-2周缩短在 7h内完成。芯片上设置了芯片表面化学质控点、杂交阳性对照点、空白对照点和每种病毒核酸对应的特异核酸探针,并且每条探针点设置 3个平行重复,只有 3个点同时出现信号才判定为有效结果,有效避免了检测过程中易出现的假阳性、假阴性现象,对芯片检测体系的重复性试验表明所建立的检测体系具有很好的重复性,芯片批间差异轻微,本研究建立的芯片快速高通量基因芯片检测方法可应用于大规模出入境马属动物的快速筛查。

[1] BarnardB J H.Circulation ofAfrican horse sickness virus in zebra(Equus burchelli)in the KrugerNational Park,South Africa,as measured by the prevalence of type speci?c antibodies[J].Onderstepoort J Vet Res,1998,60:111-117.

[2] Prowse C V.An ABC for West Nile virus[J].Transfus Med,2003,13(1):1-7.

[3] 郭丽,王健伟,洪涛,等.冠状病毒分子生物学研究进展 [J].病毒学报,2003,19(4):376-380.

[4] Campas M,KatakisL.DNA biochip arraying,detection and Applicationstrategies[J].Trend in Analysis Chemistry,2004,23(4):40-63.

[5] 朱来华,陆承平,梁成珠,等.马疱疹病毒 1型 gD基因主要中和抗原区在大肠埃希氏菌中的表达 [J].中国兽医科技,2005,35(12):929-932.