氦氧饱和高气压暴露对铜绿假单胞菌毒力表型的诱导调节

陈双红，陈锐勇，肖卫兵，徐雄利，武文斌，巴剑波

(中国人民解放军海军医学研究所舰艇卫生研究室高气压与潜水生理学全军重点实验室，上海200433)

铜绿假单胞菌感染多见于临床免疫缺陷、烧伤和肺囊性纤维化等人群，极少见于健康个体。而本研究组调查资料显示健康潜水作业人员中耳炎、皮肤黏膜感染几乎都为铜绿假单胞菌，并且饱和潜水高气压环境中铜绿假单胞菌的非常态化职业感染已严重影响作业人员健康和作业效率［1-2］。为揭示潜水高气压环境对铜绿假单胞菌感染的适应性调节作用，本文比较研究常规生长环境和氦氧饱和高气压暴露环境下铜绿假单胞菌的生长、运动能力，关键毒力因子的分泌水平，及其对整体动物的毒力水平，并以该研究为基础，为以后进一步揭示铜绿假单胞菌的非常态化职业感染机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料铜绿假单胞菌为本单位从受试潜水员外耳道分离并鉴定。选择受试前分离的铜绿假单胞菌作为对照组，4.5 MPa氦氧饱和暴露后72、144 h的细菌作为实验组。实验用昆明种小鼠，购自第二军医大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂铜绿假单胞菌培养和分离用肉汤、血琼脂和乙酰胺培养基，上海科玛嘉公司;生化鉴定管、半固体动力培养基，青岛海博生物技术公司;刚果红-弹性硬蛋白，Sigma公司;其他生化试剂购自国药集团上海分公司。

1.1.3 主要仪器Bio-Rad酶标仪;721型分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 铜绿假单胞菌的分离鉴定和生长曲线测定铜绿假单胞菌分离鉴定参照文献［3］标准程序进行。对照组细菌和饱和暴露实验组细菌用L-broth液基调整初始浓度至1.0×104cfu/mL，37℃培养，每隔2～3 h测OD620值，每组样本设置3支平行管。同时将稀释浓度为1.0×103cfu/mL的细菌涂布于乙酰胺平板，37℃培养10 h后观察不同处理组细菌对乙酰胺酶的分解能力。

1.2.2 铜绿假单胞菌运动能力的检测用L-broth液基调整对照组和实验组细菌至初始浓度1×108cfu/mL，各取2 μL菌液点种于半固体运动检测培养基表面，37℃静置培养24 h后观察结果并拍照。

1.2.3 绿脓菌素含量测定［4］用L-broth液基调整对照组、实验组细菌浓度至1.0×105cfu/mL，各取500 μL至5 mL L-broth液基，37℃震荡培养12 h。然后将培养混悬液分别离心留取上层培养液，加入等体积氯仿充分振荡2 h。随后移出有机相，加入1/5体积的1 mol/L盐酸，混合后静置10 min，取上层盐酸相测OD520值，每个样本设置3个平行管。同时各组细菌以1.0×103cfu/mL浓度平铺于绿脓菌素显色培养板，37℃培养直观观察绿脓菌素变化并拍照。

1.2.4 弹性蛋白酶活性测定［5］细菌的处理和培养同1.2.3，培养液离心取上清，每1 mL上清液中加入20 mg刚果红-弹性硬蛋白、1 mL Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.2;0.5 mmol/L CaCl2)。该混合物37℃振荡反应6 h，加入0.1 mL 0.12 mol/L的EDTA置于冰上终止反应。离心除去未溶解的刚果红-弹性硬蛋白，上清液于酶标仪495 nm处测OD值。

1.2.5 小鼠毒力实验雌性昆明种小鼠(20±2)g 30只，随机分3组，每组10只，对照组细菌和实验暴露组细菌调整浓度至1×108cfu/mL，每只小鼠腹腔注射100 μL菌液。同时设置等量L-broth液基注射的空白对照小鼠组。每天记录小鼠的存活数量，计算存活率。

1.2.6 统计学分析根据实验结果数据分布特点和性质，选用SPSS统计分析软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 铜绿假单胞菌生长曲线测定

实验中将对照组细菌、饱和加压暴露后细菌以1×103cfu/mL浓度涂布于乙酰胺平板，10 h后观察显示实验组细菌对乙酰胺的分解速度明显快于对照组(图1A)。表明暴露组细菌乙酰胺酶的分泌水平高于对照组，亦即铜绿假单胞菌通过快速分解乙酰胺提供细胞生长所需碳源。平行进行的细菌生长曲线的测定结果显示经短暂扩增2 h后，同一检测时相点暴露组细菌在620 nm处的OD值明显高于对照菌(P＜0.01)。同一扩增时相点暴露144 h组细菌增殖能力高于暴露72 h组，但无显著性差异(图1B)。该研究结果表明，饱和暴露条件影响实验菌的生长速度，并提高了细菌对乙酰胺酶的分泌能力，以适应细菌快速增殖对细胞外碳源的利用。2暴露组结果的比较表明，经72 h饱和暴露诱导后细菌生长特性达到对环境调节的阶段性稳态适应，进一步生物学性状诱导改变则可能需要更长时间(＞144 h)的慢性暴露。

2.2 铜绿假单胞菌运动能力测定

对照组和不同暴露组细菌点种于半固体动力培养基生长24 h后结果显示，暴露组细菌的运动能力明显强于对照组细菌(图2)。研究表明，细菌运动能力增强是其在宿主体内侵袭和定植功能得以快速实现的前提。因此，暴露环境对细菌运动能力的正向诱导调节作用与氦氧饱和暴露环境人群铜绿假单胞菌职业感染高发密切相关。

2.3 细菌弹性蛋白酶活性测定

对照组和暴露组细菌细胞外液弹性蛋白酶对刚果红-弹性硬蛋白的分解能力见图3。结果表明，相同浓度细菌的细胞外培养液弹性蛋白酶对底物的分解能力不同，暴露组细菌细胞外液弹性蛋白酶对底物的分解能力明显强于对照组细菌(P＜0.05)，2实验组之间差异不明显。因此，饱和暴露条件可能是通过提高细菌弹性蛋白酶的产量或其活性而增强其对底物(弹性硬蛋白)的分解能力，以达到对周围组织的快速破坏，适应快速生长的营养需求。而在72～144 h的饱和暴露时程中细菌的部分生物学特性可能处在适应调节的稳态阶段，故而实验组结果差异不明显。

2.4 铜绿假单胞菌绿脓菌素测定

对照组和饱和加压暴露后细菌以1×103cfu/mL浓度涂布于绿脓菌素测定用培养平板，12 h后观察显示，实验组细菌绿脓菌素产量明显高于对照组(图4A)。培养液盐酸显色后测520 nm处的OD值也证明这一结果(P＜0.05)，144 h暴露组绿脓菌素产量高于72 h暴露组(图4A，B)。

图3 氦氧饱和高气压暴露后铜绿假单胞菌细胞外液对弹性蛋白的活性测定Fig.3 The activity of elastic of hyperbaric oxyhelium exposure Pseudomonas aeruginosa

图4 氦氧饱和高气压暴露后铜绿假单胞菌绿脓菌素的含量检测Fig.4 The level of pyocyanin of hyperbaric oxyhelium exposure pseudomonas aeruginosa

2.5 铜绿假单胞菌对小鼠毒力的测定

整体动物水平的毒力实验表明，饱和暴露细菌注射组小鼠半数死亡时间≤4 d，对照组细菌注射组小鼠的半数死亡时间≥11 d，L-broth液基空白对照组小鼠在整个观察期无死亡(图5)。实验组与对照组毒力经Long-rank分析具有统计学意义(P＜0.01)。因此，动物染毒实验结果进一步证明氦氧饱和高压暴露后细菌毒力增强。

图5 氦氧饱和暴露铜绿假单胞菌小鼠染毒存活率Fig.5 Survival ratios of mice infected with hyperbaric oxyhelium exposure pseudomonas aeruginosa

3 讨论

氦氧饱和高气压潜水作业与普通环境差异大，常规潜水作业压力范围为0.6～4.6 MPa，远远超出普通细菌生长的0.1 MPa范围。资料显示，2 MPa以下的压力对普通细菌的生长和分化就已产生明显影响，50 MPa压力将使耐压菌的生长分化完全抑制。压力作用下细菌主要通过调整细胞膜结构、膜蛋白成分、骨架结构、细胞内酶活性、关键基因的表达水平等以适应特殊环境下的生存压力［2，6-7］。铜绿假单胞菌对环境有极强的适应性，环境信号刺激激活铜绿假单胞菌诸多调节系统进而有序调控目的基因和蛋白表达，是实现种内、种间交流并完成生物特异适应性的关键步骤。研究表明，铜绿假单胞菌接受环境信号刺激并被激活的因子主要包括与毒力调节、生物膜形成、鞭毛运动、细菌与宿主间的识别等致病相关的关键因子。细菌通过对这些因子功能的调节，最终实现利于种群生长、侵袭、定植、免疫逃避和耐药性产生等有益生长表型［7-12］。

生理状况下铜绿假单胞菌的致病性主要取决于鞭毛、菌毛的运动黏附能力、破坏宿主组织细胞的胞外产物如绿脓菌素、弹性蛋白酶的分泌，以及一些主要致病因子，如细胞外毒素、外膜蛋白的活性等，其中与细菌运动黏附、侵袭定植等相关的毒性因子在其急性感染期起重要作用［13］。由于在氦氧饱和高气压暴露下铜绿假单胞菌引起的多为急性感染，故本研究主要选择与急性感染相关的毒力因子表型作为研究对象。结果显示，暴露后传代的铜绿假单胞菌在普通生长环境中出现快速增殖，并且通过提高单位细胞乙酰胺酶的产量快速分解培养基中乙酰胺以提供生长所需碳源;暴露后铜绿假单胞菌的运动能力明显强于对照组细菌;弹性蛋白酶和绿脓菌素是细菌破坏宿主细胞组织实现侵袭感染的主要毒力因子，这些毒力因子在暴露后都出现分泌水平或生理活性的明显增加。

维持种群生长密度是细菌感染适应的前提，运动黏附是细菌感染侵袭定植的基础，实现侵袭定植是细菌感染宿主并继续维持种群繁荣的最终目的。本研究的最终结果表明氦氧饱和高气压暴露环境对铜绿假单胞菌急性感染毒力因子表型有正向调节作用，这可能是该环境中铜绿假单胞菌的职业化高感染率发生的主要原因。然而，氦氧饱和高气压暴露通过何种途径实现对铜绿假单胞菌毒力表型的正向调节还是一个需要进一步研究的内容，明确该调控机制将对预防和控制职业性高感染率有重要意义。

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