大豆根瘤菌HH103菌株培养基的筛选与优化

肖亦农，徐琼

(沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳110866)

空气中约78%的氮气不能被植物直接利用，只有固氮微生物具有将氮气转化成氨的能力，人们称为生物固氮。人们发现，根瘤菌与豆科植物共生固氮体系是自然界固氮效率最高、固氮量最大的生物固氮体系［1-2］。根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰阴性细菌，它可以侵染豆科植物根部，形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养［3］。快生型大豆根瘤菌最早是在1982年由美国学者Keyser与中国学者胡济生发现并分离的［4］。快生型大豆根瘤菌具有端生多鞭毛的形态和菌株生长快的特点，这使得快生型菌株在菌剂生产和与慢生型菌株对大豆结瘤竞争方面均具有较大优势。快生型大豆根瘤菌一般还具有不同程度的耐盐能力，代谢过程产酸，能利用广泛的碳源等特性，此外，还有报道发现某些菌株对大豆胞囊线虫和大豆根腐病菌具有拮抗作用［5］。由于这些原因，使得深入研究根瘤菌的生理代谢并在生产上的应用都具有重要的意义和应用价值［6-7］。本研究通过单因素试验和正交试验优化筛选最适合大豆根瘤菌HH103生长的培养基及配方，以期为根瘤菌今后的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种快生型大豆根瘤菌HH103，由沈阳农业大学微生物教研室提供。

1.1.2 培养基YMA液体培养基(g/L):甘露醇10，酵母膏1，K2HPO40.5，NaCl 0.1，CaCl 0.05，MgSO40.2，(Rh溶液:H3BO35，Na2MoO45，蒸馏水1 000 mL);甘油培养基(g/L):K2HPO40.5，MnSO4·6H2O 0.005，CaCl20.1，KH2PO40.5，MgSO40.2，KNO30.7，(NH4)2HPO40.3，FeCl3·6H2O 0.005，甘油10 mL，酵母膏1，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化从斜面挑取1环HH103快生型大豆根瘤菌，接种在YMA液体培养基中，125 r/min，(28±1)℃培养，至菌液浑浊(A420=10.0)。

1.2.2 HH103菌株在2种培养基上的生长曲线

每种液体培养基分装至8个250 mL的三角瓶中，每瓶装50 mL进行培养，其中一瓶为对照。按1%的接种量接种，(28±1)℃，摇床转数125 r/min。每4 h各取1瓶，以722型分光光度计测定培养菌液的A420值为纵坐标，培养时间为横坐标作图，即得到HH103快生型大豆根瘤菌在不同培养基中的生长曲线。

1.2.3 培养基中不同碳源对菌株生长的影响改变原培养基中的碳源成分，分别以蔗糖、葡萄糖和甘油为碳源进行比较。每种培养基配制250 mL，装4瓶，按1%的接种量接种，(28±1)℃，摇床转数125 r/min，培养24 h，测定A420值。

1.2.4 培养基中氮源、缓冲液对菌株生长的影响

本次试验共分5组。均是在甘油培养基基础上。以蔗糖为碳源，各组成份略有差异:X组为全量，即完全保留甘油培养基原成分;A组无KNO3;B组无(NH4)2HPO4;C组无K2HPO4;D组无

KH2PO4。(28±1)℃，125 r/min，培养24 h，测定A420值，并进行方差分析。

1.2.5 正交试验根据上述单因子试验得出结果，选定甘油培养基的碳源、酵母膏、氮源、缓冲液4个因素，分别取3个水平，并按L9(34)进行正交试验，通过极差分析得出较优组合和影响菌体生长因素的主次顺序。以方差分析结果为依据，列出其中的关键因素的显著性，制定出本试验范围内适合HH103快生型大豆根瘤菌生长的最佳配方。

2 结果与分析

2.1 HH103菌株培养基的选择

本次试验的目的是选择适于菌体生长、缓冲性和稳定性好、成本低廉、来源广的最佳培养基配方。从图1中看出，HH103快生型大豆根瘤菌在2种培养基中生长滞留期均较短，有利于菌株生长。但就生长趋势而言，YMA更占优势。进入对数生长期后的前19 h，菌株在YMA培养基中的菌体生物量继续保持优势;但19 h后，甘油培养基的生长量超过YMA培养基，表现出甘油培养基的优势。鉴于甘油培养基在19 h后菌体生长量超过YMA培养基，并在整个24 h培养过程中曲线较YMA培养基变化小，整体上是平稳的，有利于菌体正常生长，甘油培养基成为本次试验最佳培养基。

图1 不同培养基中HH103菌株生长曲线Fig.1 Growth curve of strain HH103 in different culture

2.2 培养基中不同碳源对HH103快生型大豆根瘤菌生长的影响

碳源是培养基的重要成分，如何选择碳源将关系到能否满足菌体对养分的需求。本次试验选定蔗糖、葡萄糖、甘油为碳源，在(28±1)℃、摇床125 r/min条件下培养24 h，测定A420值。试验结果见图2。由图2可知，蔗糖与葡萄糖培养基间差异显著(P=0.004＜0.01)，蔗糖与甘油培养基间差异不显著，甘油与葡萄糖培养基间不显著。比起成本相对高昂的葡萄糖与甘油，蔗糖无疑成为最佳碳源。

2.3 培养基的优化

鉴于原培养基成分较多，为简化大量生产的环节与工序，也为下一步正交试验减少决定因素，首先对培养基成分进行优化。培养基中起到调节作用的KH2PO4与K2HPO4可为根瘤菌生长提供磷素营养;同样培养基中还有KNO3、(NH4)2HPO4两种氮源供给(前者为硝态氮，后者为氨态氮)，为了研究哪种成分更有利于菌株的代谢生长，从而筛选有利于菌株吸收的物质简化培养基组分。各组分对菌株生长影响方差分析见表1。

图2 不同碳源条件下HH103菌株的生物量Fig.2 Effect of different carbon sourceson the biomass of strain HH103

表1 不同成分培养基对HH103菌株生长的影响Table 1 Effect of different culture medium composition on strain HH103 growth

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance

表3 差异显著性表Table 3 Significance level

从表1中不难得出，X组菌体生长量分别比A组多11.1%，比B组多7.5%，比C组多8.7%，比D组多7.2%。因此，在原培养基中上述4种成分均不可缺少。表2、3方差分析说明，F＞F0.01即本次试验中考察的4种培养基成分对HH103菌株生长的影响极显著。

2.4 正交试验

对于以上单因素试验结果的分析表明:蔗糖、生长因子、氮源(KNO3、(NH4)2HPO4)以及缓冲剂(K2HPO4、KH2PO4)用量4个因素，对HH103快生型大豆根瘤菌的生长有较大影响。本次试验采用L9(34)正交表在原培养基基础上对以上4种因素进行试验(见表4)。

表4 培养基配方正交试验因素水平表Table 4 Factors and levels array of orthogonal experiment about incubation condition

由表6的方差分析，氮源(KNO3、(NH4)2HPO4)影响极其显著，缓冲剂(K2HPO4、KH2PO4)影响极其显著，碳源、生长因子影响不显著。结合表5极差分析结果，4种因素的显著顺序为氮源(KNO3、(NH4)2HPO4)＞缓冲剂(K2HPO4、KH2PO4)＞生长因子＞碳源。根据对本次试验结果的分析得到改良培养基配方(g/L):K2HPO40.5，MnSO4·4H2O 0.005，CaCl20.1，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，KNO30.77，(NH4)2HPO40.33，FeCl3·6H2O 0.005，蔗糖11，酵母膏0.9，pH 7.2。

表5 培养基配方的正交试验结果及其极差分析Table 5 Analysis of variance for the result of the orthogonal experiment on medium component

表6 方差分析表Table 6 Analysis of variance

3 结论

快生型根瘤菌HH103在YMA培养基、甘油培养基中菌体的生长曲线，证明甘油培养基更适合菌体生长，因此，选定甘油培养基为改良培养基的基础。

以蔗糖、葡萄糖、甘油分别作为原培养基中的碳源，试验数据说明，菌体在以蔗糖为碳源的培养基中生长状况较好，而且来源比甘油更加广泛且经济，因此确定蔗糖为改良培养基碳源。

在以上试验的基础上，选取蔗糖、生长因子、氮源(KNO3、(NH4)2HPO4)、缓冲剂(KH2PO4、K2HPO4)4个对菌体生长有显著影响的因素进行正交试验，通过极差分析得出，在本试验范围内，改良培养基配方(g/L):K2HPO40.5，MnSO40.005，CaCl20.1，KH2PO40.5，MgSO40.2，KNO30.77，(NH4)2HPO40.33，FeCl30.005，蔗糖11，酵母膏0.9，pH 7.2。

［1］ 朱剑光，尉亚辉，吴艺舟.花生慢生根瘤菌的分离与鉴定［J］.生物技术，2006，16(2):45-47.

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［6］ 林范学.快生型大豆根瘤菌研究进展［J］.济宁师专学报，1999，(6):50-51.

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