致死型夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在Th2免疫应答极化中的作用研究

冯辉，冯永辉，李莹，朱晓彤，潘艳艳，曹雅明

(中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳110001)

在疟疾感染早期，以树突状细胞为主的抗原提呈细胞通过激活特异性CD4+和CD8+T细胞启动抗疟保护性细胞免疫应答。以IL-12、IFN-γ和TNF-α分泌为主的Th1型细胞免疫应答控制红内期疟原虫的爆发性增殖。随后，以Th2型细胞因子辅助B细胞分泌疟原虫特异性抗体，最终清除疟原虫［1-2］。有效地调控Th1和Th2型应答不仅能有效清除疟原虫，而且能最小限度地防止疟疾相关病理性损伤［3］。维持前炎症性免疫应答和免疫病理损伤之间的平衡有赖于Treg细胞的免疫调控作用［4］。流行区个体和鼠疟模型均已表明疟疾感染引起Treg细胞数量改变，Treg细胞比例失衡将导致抗疟免疫应答受抑制［5-6］。研究证实，Treg细胞参与抑制抗疟前炎症细胞因子应答水平［7］，但在调控体液免疫应答中的作用尚未充分阐明。前期研究显示，致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL，P.y 17XL)感染中Treg细胞参与Th1型免疫应答的调控［8-9］。为深入探讨Treg细胞在疟疾感染中的作用地位，本研究动态检测了致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi AS，P.c chabaudi AS)感染BALB/c和Treg细胞消除小鼠体内Th2型体液免疫应答特点，以期进一步明确P.c chabaudi AS感染中Treg细胞对Th2免疫应答的调控效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、疟原虫6～8周龄，BALB/c小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心;P.c chabaudi AS，日本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠。

1.1.2 主要试剂以下单克隆抗体(mAb)均购自美国BD Bioscience:抗-CD4-FITC mAb(GK 1.5)、抗-CD25-PE mAb(PC61)和FcγIII/II封闭抗体(2.4G2)。抗-Foxp3-APC mAb(FJK-16S)和Foxp3胞内染色试剂盒购自美国eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物感染和Treg细胞消除模型制备

小鼠经腹腔感染1×106P.c chabaudi AS寄生的红细胞(pRBC)，小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，显微镜检计数红细胞感染率。小鼠在P.c chabaudi AS感染后5～7 d连续3 d腹腔注射Anti-CD25mAb(7D4，IgM)1 mg/只/次，构建Treg细胞消除鼠疟模型。对照组在同一时间点注射等量PBS。

1.2.2 脾CD4+CD25+Foxp3+细胞流式染色无菌取出小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解红细胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640调整脾细胞终浓度为1×107/mL。取0.1 mL脾细胞悬液，预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体1 μg封闭30 min。设阴性对照管，抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE和抗-Foxp3-APC单标管。每份样品同时用抗-CD4-FITC mAb和抗-CD25-PE mAb进行细胞表面双色标记4℃孵育30 min。洗涤1次，弃上清。每管加0.25 mL Foxp3固定透膜剂，4℃孵育30 min。洗涤1次，弃上清。每管再加入抗-Foxp3-APC mAb进行胞内染色，4℃孵育30 min。洗涤1次。弃上清，用0.5 mL FBS/PBS重悬细胞，待流式细胞仪进行检测。

1.2.3 细胞获取与分析利用流式细胞仪(FACAriaⅡ，美国B＆D公司)获取细胞，使用前向散射角(FSC)及侧向散射角(SSC)确定淋巴细胞群。以阴性对照为参考，将对照管所示的非特异荧光的99%以上作为本底扣除，以单标管为对照，调整不同荧光通道补偿。每个样品获取10 000～50 000个细胞。结果以二维点阵图显示。利用FAC expressV3 software分析流式结果。

1.2.4 疟原虫特异性抗体IgG1和IgG2a水平检测按常规方法，简要叙述如下。10 μg/mL溶解在pH 9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液P.c chabaudi AS粗提抗原100 μL/孔包被96板4℃过夜。PBST洗3遍。1%BSA 200 μL/孔37℃封闭1 h。PBST洗3遍。待检血清按1∶50到1∶6 400倍比稀释，100 μL/孔37℃孵育2 h。PBST洗3遍。分别将1∶2 000倍稀释生物素偶联大鼠抗小鼠IgG1(Serotec)和1∶4 000倍稀释生物素偶联大鼠抗小鼠IgG2a(Serotec)抗体，100 μL/孔37℃孵育2 h。PBST洗3遍。亲和素-辣根过氧化物酶-抗体，100 μL/孔37℃孵育2 h。PBST洗3遍。100 μL/孔加底物TMB，室温孵育30 min。50 μL/孔加2 mmol/L H2SO4终止反应。450 nm检测吸光度。以空白对照OD值为标准，以最接近空白对照OD值的最大稀释倍数倒数作为待检样品抗体效价。

1.2.5 统计学分析应用SPSS 11.5统计学分析软件，Student's t test比较分析组内和组间均值的显著性差异。P≤0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 P.c chabaudi AS感染Treg细胞消除和对照组的原虫血症和生存率

Treg细胞消除和对照组小鼠于感染后5 d外周血均可见疟原虫感染红细胞。随后，对照组原虫血症迅速上升，在感染后8 d达到峰值40.5%后，于感染后10 d迅速下降至3%，在感染后18 d外周血中疟原虫被彻底清除。对照组小鼠全部自愈(图1)。Treg细胞消除组在感染后6～10 d，原虫血症水平处于5%～10%。于感染后10 d，原虫血症水平迅速上升至32%，随后小鼠相继死亡(图1)。

2.2 P.c chabaudi AS感染Treg细胞消除鼠和对照组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量

Treg细胞消除鼠于感染后5～7 d连续3 d腹腔注射Anti-CD25mAb。为检测Treg细胞消除效果，在感染后8～10 d，FACs检测了CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞的百分含量。在感染后8 d，Treg细胞消除鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞百分含量从11.26%降至0.47%(P＜0.05)。在感染后10 d，Treg细胞消除鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞百分含量亦明显低于对照组(P＜0.05，9.99%v 2.04%)(图2)。

图1 P.c chabaudi AS感染后小鼠原虫血症(A)和生存率(B)Fig.1 P.c chabaudi AS infection in DBA/2 control and CD25-depleted mice.Parasitemia(A)and survival rate of mice(B)

图2 P.c chabaudi AS感染后8 d和10 d脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量比较(A)结果以流式散点图显示;(B)2组小鼠CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+T细胞百分含量比较Fig.2 Flow cytometric analysis of splenocytes to show the depletion of CD25+cells in DBA/2 mice infected with P.c chabaudi AS treated with 7D4 mAb

2.3 P.c chabaudi AS感染Treg细胞消除鼠和对照组的特异性抗体水平

在感染后10 d，BALB/c小鼠血清中以疟原虫特异性IgG1抗体为主。与对照组相比，Treg细胞消除鼠疟原虫特异性抗体IgG1水平明显降低(P＜0.05)，同时，疟原虫特异性抗体IgG2a水平亦明显降低(P＜0.05)(图3)。

图3 P.c chabaudi AS感染后2组小鼠特异性抗体IgG1(A)和IgG2a(B)水平检测Fig.3 The level of malaria specific antibodies in DBA/2 mice infected with P.c chabaudi AS

3 讨论

本研究结果显示，Treg细胞消除和对照组小鼠于感染后5 d外周血均可见P.c chabaudi AS疟原虫感染红细胞。对照组小鼠在感染后8 d，原虫血症达峰值，随后浆细胞数量和疟原虫特异性抗体水平明显增加，同时原虫血症迅速下降，最终小鼠自愈。相比，Treg细胞消除鼠在感染后6～10 d原虫血症明显低于对照组，在感染后10 d原虫血症迅速上升，此时脾脏浆细胞数量和疟原虫特异性抗体水平明显低于对照组，同时，CD4+CD25+Foxp3+细胞数量明显低于对照组。Treg细胞消除鼠于原虫血症达峰值后相继死亡。由此表明，P.c chabaudi AS感染中Treg细胞参与调控体液免疫应答。

红内期保护性免疫应答的建立有赖于Th细胞免疫应答的有效建立和协调过渡。疟疾感染急性期，有效控制原虫早期爆发性增殖有赖于前炎症因子的应答水平，而最终清除疟原虫具有抗体依赖的特性。前期研究结果表明CD4+CD25+Foxp3+细胞参与抑制Th1型免疫应答的建立。本研究结果进一步提示，P.c chabaudi AS感染中CD4+CD25+Foxp3+细胞对Th极化和体液免疫应答的建立发挥重要的免疫调控作用，其可能的作用机制有待进一步阐明。

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