稀土对大菱鲆生长和非特异性免疫力的影响*

崔丽卿,徐 玮,汪东风

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛266003)

大菱鲆(Scophthalm usm axim us)为原产于欧洲沿海的冷水性鲆科鱼类,该鱼性格温顺、生长迅速、肉质鲜嫩,自1992年引入我国,大菱鲆养殖已覆盖山东、江苏、浙江和福建等省份,成为我国重要的海水养殖鱼类[1]。然而随着养殖密度的增加,水体环境的恶化,各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫疾病时有发生[2]。抗生素这类药物经常用于病害的诊治,但却直接导致了耐药菌株增加、药物残留等问题。而在饲料中添加免疫刺激剂[3],通过增强养殖动物自身免疫力来预防疾病,例如β-葡聚糖、甘露聚糖等,已被证明是1种低成本、高效、环保的预防疾病的方式。

根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)对稀土元素的定义,稀土元素是指元素周期表第三副族中原子序数从57(La)至71(Lu)的15个元素(称为镧系元素),再加上与其电子结构和化学性质相似的钪(Sc)和钇(Y)。我国有丰富的稀土资源[4],由于稀土具有促生长的作用,已广泛用于农作物、畜禽和渔业养殖[5-7]中。朱伯清等[8]通过在中国对虾的饲料中添加氯化稀土,其产量增加31%,但目前为止稀土作为免疫刺激剂用于大菱鲆养殖中还未见报道。本实验以大菱鲆为研究对象,通过在饲料中添加稀土,考察其对鱼体生长指标、非特异免疫力和抗病力的影响,以期为大菱鲆免疫刺激剂的开发和合理应用提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

实验以鱼粉(购自青岛七好有限公司)为主要蛋白源,鱼油和大豆卵磷脂为主要脂肪源,小麦粉为糖源,配制粗蛋白含量为53.01%,粗脂肪含量为12.57%,灰分含量为9.50%的基础饲料。在基础饲料中分别添加0、240 mg/kg的硝酸稀土,经制粒机加工成3.0 mm颗粒状饲料,在50℃恒温下干燥12 h,密封保存。硝酸稀土购自河南商丘稀土微肥有限公司,经ICP-OES(V ISTA-M PX,VARIAN)所测得到硝酸稀土中含镧9.53%,铽5.38%,镝2.47%,铥1.72%,钬1.51%,镥0.18%,即硝酸稀土中所含稀土总量为20.79%。

1.2 实验用鱼及样品采集

实验用大菱鲆幼鱼为当年人工培育的同一批苗种。实验在青岛国家海洋科学研究中心中国海洋大学科研基地进行。实验前,大菱鲆于300 L玻璃钢中暂养,使其适应养殖环境。实验共设2个处理,每个处理3个重复,每桶放养40尾大菱鲆,每天投喂2次(7··00,18··00),采取饱食投喂。实验周期为8周,期间24 h连续充氧。

8周生长实验结束后,对大菱鲆饥饿24 h,然后计数,称重。分别从每桶随机取5尾鱼,用1 m L无菌注射器自尾静脉取血,每组实验鱼所得血液均分成2份:1份加肝素钠抗凝后用于吞噬指数的测定;1份不加抗凝剂,于4℃冰箱中静置过夜,吸取上层血清于1.5 m L离心管中,放于-70℃冰箱中用于酶活性测定。

1.3 样品分析测定方法

1.3.1 吞噬指数(Phagocytic index,PI)测定 将金黄色葡萄球菌接种于营养肉汤中,放37℃摇床中培养12 h左右,4 000 r·min-1离心10 min,取沉淀,用无菌生理盐水稀释成1.7×109cfu/m L备用。

大菱鲆自尾静脉取血后,每毫升血液中立即添加0.2 m L肝素钠(浓度为1 500 U/m L),轻轻摇动混匀。取100μL抗凝血,放入96孔培养板中,再加上述葡萄球菌菌液100μL充分混匀,37℃水浴30 min,其间每隔10 min摇匀1次。

作用完毕,取1小滴混合液置于洁净无油污的载玻片一端,推成薄片。待干后,用Giemsa染液染色2～3 min,水洗,脱色,置油镜下观察。随机计数100个参与吞噬的中性粒细胞,同时记录所吞噬的细菌数并计算吞噬指数。

吞噬指数=Po/100

式中,Po为参与吞噬的中性粒细胞所吞噬的细菌数,100为参与吞噬的中性粒细胞数目。

1.3.2 超氧化岐化酶(Super oxide dismutase,SOD)活力测定 SOD活力测定,采用从南京建成生物工程研究所购买的检测试剂盒,相应操作参照说明书进行。其中,SOD活力按黄嘌呤氧化酶法,活力单位定义为:每mL反应液中SOD抑制率达50%所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U/m L)。

1.4 攻毒试验

生长试验结束后,分别从每桶随机选10尾鱼进行攻毒实验。用一次性注射器通过腹腔注射迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)菌液0.2 m L/尾(菌液浓度为105cfu/mL),攻毒所用菌种由中国海洋大学生命学院提供,为大菱鲆腹水病病原菌。饲喂及饲养管理与饲养实验期间相同,同时记录攻毒7 d后鱼的死亡率。

1.5 计算及统计分析

(1)成活率(%)=(No-Nt)/No×100%

(2)增重率(%)=(Wt-Wo)/Wo×100%

(3)饲料系数=F/W

(4)特定生长率(%/d)=(Ln Wt-Ln Wo)×100/t

(5)肝脏指数(%)=m1/Wt×100

(6)肾脏指数(%)=m2/Wt×100

式中,No和Nt分别为每桶初始和死亡的大菱鲆尾数,Wo和Wt分别为大菱鲆的初始体重和终末体重(g),t为实验天数(d),F为重复组饲料总摄入量,W为重复组总鱼体增重,m1为每尾鱼的肝脏质量(g),m2为每尾鱼的肾脏质量(g)。

实验数据采用SPSS 18.0软件进行配对样本T检验,均表示为平均值±标准误(M ean±S.E.M),以P<0.05作为差异显著水平。

2 结果

2.1 稀土对大菱鲆增重率、特定生长率、饲料系数以及成活率的影响

稀土对大菱鲆生长的影响见表1。经过8周饲养实验后,饲料中添加稀土的大菱鲆成活率为93.7%,高于对照组(86.0%)。实验中大菱鲆的特定生长率、增重率与成活率有相似的规律,即与对照组相比,稀土组大菱鲆特定生长率提高了15.79%,增重率提高了26.88%,而稀土组的饲料系数为0.9,显著低于对照组(1.6)(P<0.05)。

表1 稀土对大菱鲆增重率、特定生长率、饲料系数以及成活率的影响Table 1 Effects of rare earth elements on weight gain rate,specific grow th rate,feed coefficient and survival of Scophthalm usm ax im us

2.2 稀土对大菱鲆吞噬指数、肝脏指数以及肾脏指数的影响

稀土对大菱鲆吞噬指数、肝脏指数以及肾脏指数的测定结果见表2。饲料中添加稀土的大菱鲆吞噬指数为117.2,高于对照组(114.0)。与对照组相比,稀土组大菱鲆肝脏指数提高了24.70%,肾脏指数提高了9.52%。

表2 稀土对大菱鲆吞噬指数、肝脏指数以及肾脏指数的影响Table 2 Effects of rare earth elements on phagocytic index,liver index and renal index of Scophthalmusmaxim us

2.3 稀土对大菱鲆超氧化歧化酶的影响

稀土对大菱鲆超氧化歧化酶的测定结果见图1。饲料中添加稀土的大菱鲆SOD酶活为58.3,高于对照组(53.6)。

图1 稀土对大菱鲆超氧化歧化酶的影响Fig.1 Effects of rare earth elements on super oxide dismutase of Scophthalmusmaximus

2.4 稀土对由迟缓爱德华氏菌所感染的大菱鲆死亡率的影响

稀土对由迟缓爱德华氏菌所感染的大菱鲆死亡率影响的测定结果见图2。经过7d的攻毒实验,稀土组的死亡率低于正常组,饲料中添加稀土可以提高大菱鲆抵抗腹水病的能力。

图2 稀土对由迟缓爱德华氏菌所感染的大菱鲆死亡率的影响Fig.2 Effects of rare earth elements on mo rtality of Scophthalm usm axim us,challenged with Echw ardsiella tarda

3 讨论

本实验中硝酸稀土的添加剂量为240 mg/kg,而硝酸稀土中所含稀土为20.79%,即饲料中稀土的有效含量为49.90 m g/kg,而中国稀土农用网[9]发布的:鱼类饲料中的稀土以50 mg/kg为宜,两者数据相近。经过8周的饲养实验,饲料中添加稀土后,大菱鲆的成活率提高了8.95%,而且特定生长率提高了15.79%,增重率提高了26.88%。而饲料系数降低了43.75%,这与以前的研究结果相类似。江振莹[10]用700 g/m3稀土溶液浸泡鱼体,结果鲤鱼体增重16.1%,同时鲤鱼的成活率也提高了。石文雷等[11]研究表明,饲料中添加Vc稀土(团头鲂36.94～42.77 mg/kg,草鱼54.56～58.87 mg/kg)可促进鱼体生长,降低饵料系数,并且提高成活率。

吞噬能力是鱼类的非特异性免疫功能的重要组成部分,当细菌等异物侵入机体时,血液中的白细胞会发挥趋化作用向其聚集,通过胞吞作用将异物吞噬。本实验饲料中添加稀土喂养的大菱鲆血液中性粒细胞的吞噬指数高于对照组,实验结果表明,稀土有效地激活大菱鲆吞噬细胞的吞噬功能,从而使其非特异性免疫力得到改善与提高。申秀英等[12]证实,中、低浓度的铈显著增加大鼠血液中性粒细胞的数量,并且低浓度的铈使淋巴细胞所占白细胞的比例升高,提高了大鼠的免疫力。王宗惠等[13]研究发现,在4～125μg/mL剂量范围内,稀土能够促进巨噬细胞特异吞噬功能,并呈剂量反应依赖关系。马文强等[14]表明,补充一定量的稀土元素,可改善机体的细胞免疫和体液免疫。而有关稀土提高吞噬指数的机理,也有学者进行了相关的研究。M izgerd等[15]的研究表明,稀土能够被巨噬细胞所吞噬从而促进细胞调亡。

SOD酶具有清除活性氧的功能,是生物体内主要抗氧化酶类之一,在防御机体衰老方面有极为重要的作用。本实验饲料中添加稀土喂养的大菱鲆SOD酶活性高于对照组。稀土离子半径较小,表现为硬酸性,容易与作为硬碱的氧结合[16],可以通过此机制清除活性氧。活性氧的数量与杀菌力存在相关关系,是反映非特异性免疫能力的一项指标。汪承润等[17]研究发现,低剂量硝酸钬可增强机体SOD、CAT、POD 3种抗氧化酶活力。Y.Chen等[18]研究表明,金鱼经过18 d La3+、Gd3+、Y3+浸浴处理后,肝脏SOD酶活的增加率分别为15.58%、16.8%和24.8%;而经过La-ED TA、Gd-ED TA、Y-ED TA处理后,肝脏SOD酶活的增加率分别为16.4%、22.6%和35.2%。邵红星[19]等研究发现,在饲料中添加500m g/kg的“常乐”稀土后,鲤鱼肝胰脏CA T酶活达到最大值。

攻毒实验是免疫刺激剂效果最直观的反映方式,迟缓爱德华氏菌[20]是大菱鲆腹水病的主要致病菌之一。攻毒实验结果表明,摄食稀土后大菱鲆抵抗迟缓爱德华氏菌感染的能力增强,这与吞噬指数、超氧化岐化酶所反映的非特异免疫力的指标有着相似的规律。

4 结语

本研究首次研究了稀土对大菱鲆生长以及非特异性免疫力的影响。结果表明,饲料中添加稀土能促进大菱鲆生长,提高机体免疫力,增强抗病力,将其应用为大菱鲆免疫刺激剂具有广阔的前景。但稀土在海水养殖方面实际应用还有待进一步研究,例如针对不同水产动物在不同的生长阶段,施用的方式以及添加剂量的选择也是不同的;稀土对水产动物免疫力影响的机理研究报道很少。

[1] 雷霁霖.我国大菱鲆养殖现状、问题和对策[J].中国水产,2003,(11):25-27.

[2] 秦蕾,王印庚,阎斌伦.大菱鲆微生物性疾病研究进展[J].水产科学,2008,27(11):598-602.

[3] Ian Bricknell,Roy A Dalton.The use of immunostimulants in fish larval aquaculture[J].Fish and Shellfish Immunology,2005,19(5):452-472.

[4] Seishiro Hirano,Kazuo T.Suzuki.Exposure,metabolism and toxicity of rare earths and related compounds[J].Environmental Health Perspectives,1996,104(1):85-95.

[5] Germund Tyler.Rare earth elements in soil and plant systems-A review[J].Plant and Soil,2004,267(1-2):191-206.

[6] 宋永生.有机稀土对家禽养殖的应用研究[J].山东家禽,1994,7(1):9-10.

[7] 齐宏涛,汪东风,杜德红,等.稀土在水产养殖业中的应用研究进展[J].水产学杂志,2003,16(2):77-82.

[8] 朱伯清,徐明起,姚健.添加稀土元素的配合饲料对中国对虾生长效果的研究[J].中国水产科学,1995,2(2):15-22.

[9] 中国稀土农用网.稀土在养殖业上的应用效果和作用机理[EB/OL].http://www.ynny.com.cn/new s.asp?id=5,2010-08-17.

[10] 江振莹.稀土元素对鲤鱼生产性能和体内代谢的影响[J].水利渔业,2006,26(3):7-79.

[11] 石文雷,陆茂英,刘海珍,等.维生素C稀土养鱼及安全卫生评价[M].北京:科学出版社,1995.

[12] 申秀英,许晓路,章子贵,等.稀土元素铈和钐对大鼠血液学指标的影响[J].营养学报,2004,26(6):502-503.

[13] 王宗惠,庞新民,苏英,等.稀土防癌实验及对NK细胞活力影响的观察[J].卫生毒理学杂志,1994,8(3):200-202.

[14] 马文强,冯杰.稀土元素对动物免疫功能的影响[J].饲料工业,2006,27(4):52-54.

[15] Mizgerd J P,Molina RM,Stearns R C,et al.Gadolinium induce macrophage apoptosis[J].J Leukoc Biol,1996,59(2):189-195.

[16] 王伟列,涂楚桥,王光辉.稀土金属离子与酶分子的相互作用研究进展[J].稀土,1998,19(3):57-65.

[17] 汪承润,吴薇,何梅,等.硝酸钬对小鼠骨髓细胞核异常和肝脏三种抗氧化酶活力的影响[J].稀土,2004,25(5):36-40.

[18] Chen Y,Cao X D,Lu Y,et al.Effects of rare earth metal ions and their EDTA complexes on antioxidant enzymes of fish liver[J].Environmental Contamination and Toxicology,2000,65(3):357-365.

[19] 邵红星,江振莹,宗振东,等.稀土对鲤鱼肝胰脏和血液中部分酶活性的影响[J].中国饲料,1999(1):21-22.

[20] 冯守明.大菱鲆粘膜及淋巴细胞对迟缓爱德华氏菌免疫应答的研究[D].青岛:中国海洋大学,2008.