粉尘螨1类变应原（Der f1）的cDNA克隆和序列分析

于广新，张铁楠，张理涛，纪岩文

（1.天津市长征医院，天津300120 2.天津医科大学总医院，天津 300158）

尘螨是引起人类变态反应性疾病的主要变应原之一[1]。使用尘螨的主要变应原来检测尘螨过敏和进行免疫生物治疗是防治尘螨过敏性疾患的重要手段。在以往的研究中我们发现，中国大陆粉尘螨2类变应原的基因序列具有多态性，存在着一定的地域性差异[2]。因此，文中采用RT-PCR的方法，继续扩增中国大陆地区的粉尘螨Der f1cDNA片断并进行序列分析，为进一步表达重组的Der f1变应原以用于尘螨过敏性疾病的诊治或构建DNA疫苗打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 高速冷冻离心机：Heraeus公司。微量离心机：Heraeus公司。U-2001紫外分光光度仪：Hitachi公司。PCR 扩增仪 TP3000：Takara Bio-inc公司。凝胶电泳仪Mupid：Advance-BioCoLtd公司。

1.1.2 主要试剂 DNA Maker DL-2000：TaKaRa公司。Trizol试剂：Invitrogen 公司。DEPC：上海生工。低熔点琼脂：Gibcol BRL公司。DNA Ligation Kit Ver：Takara公司。DNA片段纯化与回收试剂盒：DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0 Takara公司。BKL Kit：Takara 公 司 。 逆 转 录 酶 ：AMV Reverse Transcriptase，Takara公司。逆转录引物：Oligo dTAdaptor Primer：Takara公司。PCR应用试剂来自Takara公司。SacI限制性内切酶:Takara公司。NotI限制性内切酶:TaKaRa公司。

1.1.3 数据分析软件 DNAStar、电泳成像装置ImageMasterVDS：Pharmacia Biotech公司。

1.1.4 质粒 pMD18-T Simple平滑载体和pET-32a(+)载体，来自Takara公司。

1.1.5 大肠杆菌 E.coli Competent JM109 Cell，来自TaKaRa公司。

1.1.6 引物设计与合成 检索Genebank上的Der f1序列(AB034946)，去除内含子后自行设计粉尘螨特异性引物。由大连宝生物公司合成。引物序列为：5′－AGC GCT TGC CGT ATC AAT TCG GTT AAC－3′和5′－GAGGTTGTTTCCGGCTTGGAAATATC－3′。

1.1.7 粉尘螨 中国大陆粉尘螨标准株（Dermatophagoides farinae）购自复旦大学医学院病原生物系。

1.2 方法

1.2.1 粉尘螨基因组总RNA提取 -70℃保存的粉尘螨过筛除去面粉，迅速放入匀浆器中，加Trizol试剂2mL，常规方法提取组织RNA。用50μL的无RNA酶的DEPC水溶解RNA，用移液枪吹打充分溶解后，取2μL进行1%琼脂糖电泳。结果见图1。

1.2.2 逆转录反应 以提取的总 RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为反转录引物，使用TaKaRa RNA LA PCRTM Kit（AMV）Ver 1.1进行RT反应，合成cDNA。20μL反应体系组成为：MgCl2，4 μL；10 ×RNA PCR Buffer，2μL；dNTP Mixture，2μL；RNase inhibiter，0.5μL；模板 RNA，5μL；AMV Reverse Transcriptase，1μL；Oligo dT-Adaptor Primer，1μL；DEPC-H2O，4.5μL。反应混合液轻微混合，并短暂离心聚集，按以下条件进行反转录反应：42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。

1.2.3 PCR反应扩增目的基因 以合成的cDNA为模板，使用PyrobestTMDNA Polymerase，进行PCR扩增反应。50μL 反应体系组成：10×Pyrobest Buffer，5μL；dNTP Mixture，5μL；上下游引物各 1μL；cDNA，2μL；Pyrobest DNA Polymerse(5U/μL)，0.5μL；DDW，35.5 mL。PCR反应条件：变性94℃1 min；退火50℃1 min；延伸 72℃ 1 min；35个循环。取 5μL PCR 产物进行1%琼脂糖电泳。结果见图2。

1.2.4 PCR产物回收 使用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit切胶回收目的基因。

1.2.5 目的DNA片段的末端平滑及5’末端磷酸化反应 应用TaKaRa公司的BKL Kit进行。

1.2.6 末端平滑及5’末端磷酸化目的DNA片段的纯化 用TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer2.0纯化DNA。取1μL PCR产物进行1%琼脂糖电泳。结果见图3。

1.2.7 目的DNA片断与载体连接 使用TaKaRa DNA Ligation Kit中的 SolutionⅠ，连接 DNA与pMD18-T Simple平滑载体。

1.2.8 转化大肠杆菌 首先制备大肠杆菌JM109感受态细胞。然后连接产物转化感受态细胞：取连接液（16℃）10 μL，加 100 μL 感受态细胞 E.coli JM109，混合均匀后置于冰上30min（冰上操作）。放入42℃水浴1min。迅速移至冰浴中2～3min。加入900 μL SOC培养基，混匀移入15 mL管中，37℃摇床中温育1h。12 000r/pm离心1min，将沉淀溶于100 μL上清中，在超净台中涂布于AIX平板上，放37℃温箱中过夜。

1.2.9 阳性克隆筛选和培养 挑取阳性菌落，分别用灭菌牙签挑取菌落的1/2，移至3mL加Amp的TB培养基中，37℃、220～240转摇床过夜。

1.2.10 质粒提取 用Takara Minibest Plasmid Purification Kit完成。取1μL质粒做1%琼脂糖电泳，获得两株质粒。电泳结果见图4。

1.2.11 DNA策序分析 将筛选出的1、2号两株质粒分别命名为质粒1和质粒2，以BcaBEST Primer M13-47、BcaBEST Primer RV-M为引物进行DNA测序。本实验部分由TaKaRa中国大连公司完成。

2 结果

2.1 克隆的Derf1cDNA片断的核苷酸序列分析 筛选出的两株Der f1的cDNA克隆为长度631个碱基对的核苷酸片断。序列结果与Genebank上公布的Der f1序列 (AB034946)经blast分析后，其中一株（质粒1）与Der f1序列(AB034946)完全相同，具有100%的同源性；另一株（质粒2）与Der f1序列(AB034946)分别在144、481两处位点有碱基不同，有99.7%的同源性。见图5。

2.2 克隆的Der f1 cDNA片断的氨基酸序列分析：氨基酸序列分析表明：质粒1所能产生的氨基酸序列与基因库中的完全相同；而质粒2可能产生1种氨基酸突变。见图5。

图5 Der f1 cDNA序列（atg为起始密码）

3 讨论

在目前分离提纯的12类尘螨变应原当中，每一类都有不同的的酶活性，而不同尘螨之间的同一类变应原的氨基酸序列和cDNA序列有较高的同源性。1类变应原是尘螨变应原重要的组成部分，具有巯基蛋白酶的活性，不耐热。Mr为25KDa，PI为4.5～7.2，最佳温度条件为37℃，pH为6.0。与过敏者血清IgE结合率为80%～100%。Der p1（户尘螨1类变应原）与Der f1理化性质相似，氨基酸序列高度同源，有80%序列是一致的[3]。因此在诊断和治疗上各种尘螨过敏有着共同性。但cDNA文库随机片段免疫筛选发现抗原差异的区域与序列差异的区域相对应[4]，cDNA的差异决定着氨基酸序列的差异。

至少有4种尘螨变应原具有蛋白水解酶活性。此类酶可通过非细胞毒性作用造成上皮细胞间的破坏，使变应原轻易通过气道黏膜和皮肤屏障，和免疫细胞接触，导致机体针对尘螨的超敏反应[5]。Derf1可以切断B细胞表面的CD23，消除IgE合成的抑制信号，从而诱导机体发生超敏反应。粉尘螨IgE抗体阳性的患者血清中大多含有Der f1特异性抗体，其中儿童69%，成人87%[6]，因此Der f1是主要的尘螨变应原。

户尘螨Der p1第1～4位残基互不相同，常常发生保守性改变。这种改变往往发生在个别的核苷酸和氨基酸序列。因此不会导致户尘螨变应原的大的改变，但有时这种改变可以改变抗原的血清型，这在不同地区来源的尘螨表现明显[7]。因此，有必要对这种变化和地域差异进行研究。但是粉尘螨的这种变化不是太明显，临床发现，使用国内的粉尘螨变应原进行皮肤试验和应用CAP system检测特异性IgE比较，二者具有较好的相关性[8]。我们采用RTPCR所获得的2株Der f1 cDNA片断和Genebank上公布的Der f1序列相比较，其中1株完全一致，1株仅有2个碱基差异，推测只能产生1种氨基酸突变，提示中国大陆Der f1与国际已知序列高度同源。这不仅为上述临床应用提供了遗传学的证据，同时也为开拓我国及不同地域的同一类变应原的特点分析、以及为进一步表达重组的变应原用于尘螨变应性疾病的诊治奠定了基础。

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